EZ Trans一站式慢(man)病毒包裝(zhuang)試劑盒(he)

產品(pin)描述(shu)

和元李記EZ Trans一站式慢病毒包裝試劑盒（EZ Trans Lentiviral Infection Kit）包含：慢病毒包裝質粒、對照質粒、轉染試劑（EZ Trans Regent）、慢病毒濃縮液、慢病毒感染增強劑等必要組份，可一站式高效完成病毒包裝到感染細胞的全部過程。和元李記慢病毒包裝試劑盒（Lentiviral Infection Kit）提供足量、優質的對照質粒和包裝質粒，省去實驗人員抽提質粒的工作可快速包裝病毒感染細胞。

和元李記慢病毒載體表達系統由pLenti慢病毒載體和Lentiviral Mix質粒組成。pLenti慢載體中含有HIV基本元件5’LTR和3’LTR以及WPRE等其他輔助元件，表達框為U6-shRNA(NC)-CMV-EGFP-2A-Puro，含綠色熒光和puro真核抗性。客戶可以根據不同的實驗目的針對plenti載體改造用于啟動子、基因功能功能研究，穩定株篩選等。Lentiviral Mix能夠表達病毒包裝需要的各種必需原件，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包裝系統。

訂購信息

產品組(zu)分

運(yun)輸(shu)與保存

藍冰運輸。A、B組分-20℃保存，C、D、E組分4℃保存，有效期12個月。

使(shi)用方法

一、慢病毒包裝及純化濃(nong)縮（以10 cm培養皿為例，1皿為1T）

1.        細胞準備(bei)：293T細胞按照6×10⁵cells/mL的細胞密度傳代到10cm培養皿中，第二天細胞長到80%-85%時準備轉染。

2.        轉染前換液：轉染前1h將需要轉染的細胞更換新鮮的DMEM，10mL/皿。

3.        轉(zhuan)染：

(1)       取1.5ml EP管記為質粒混合液（管A），加入500uL DMEM，16μL質粒DNA（可自行改造）和22μL包裝質粒，振蕩混勻；

(2)       另取1.5mL EP管記為轉染試劑混合液（管B），加入500uL DMEM，90μL 轉染試劑，振蕩混勻。

(3)       再將管B緩慢加入到管A中，輕輕混勻，靜置8min形成復合物，后將混合液均勻滴加到提前換好液的10cm培養皿中，輕輕混勻，放入培養箱中培養。

4.        轉染后換液(ye)：轉染后6-8h，將培養皿中的培養基吸掉，棄于廢液杯中，然后加入10mL 培養基（含有血清和抗生素）繼續培養。

5.        病毒(du)收集：轉染48h后，吸取上清液于50mL 離心管中，4000rpm離心10min, 4℃，將上清液用0.45um過濾器過濾轉移到新的50mL 離心管中。此時上清液中的病毒顆粒可以直接去檢測滴度或者感染目的細胞，如果對病毒的滴度及純度有較高要求，可進行后續操作。

6.        病毒濃縮：每10mL 病毒上清液加入2.5mL EZ慢病毒濃縮液（CAT:AC04L442），混勻，4℃放置2h，4000rpm離心30min，吸棄上清。

7.        檢測及分裝：包裝好的病毒可以直接檢測滴度，待用的病毒用EZ病毒保護液重懸分裝凍存。

二、慢病毒感染細胞（以293T細胞為例，MOI值為1）

1.         細胞鋪板(ban)：

(1)       將293T細胞配成5×10⁴cells/mL細胞懸液，待鋪板。

(2)       將上述細胞懸液接種到6孔板，每孔鋪2mL，即1×10⁵cells/well。

2.         感染慢病毒：

(1)       鋪好板細胞培養12-20h，準備感染。

(2)       加病毒，計算方法：(細胞數×MOI值/病毒原液滴度)×10³=病毒量(μL)，加病毒量見下表。

(3)       加感染增強劑：每孔加10μL 1mg/mL 感染增強劑，最終在細胞樣品中感染增強劑的終濃度為5μg/mL，輕搖使增強劑分散均勻。

(4)       換液：感染12-20h棄去培養基，每孔加入2mL 新鮮培養基。

3.         觀察：72h后(hou)觀察細胞(bao)狀態，根據情(qing)況做開展后(hou)續(xu)實驗。（可選）

注意事(shi)項(xiang)

1.         本產品僅限于科學(xue)實驗(yan)研究使用，不得用于臨(lin)床診斷、治療等領域。

2.         所有慢病毒操作均應盡量在BSL2*生物安全柜中進行，并佩戴一次性*口罩和手套。

3.         病毒切忌反復凍融，凍融一次病毒滴度降低10%-20%左右。

4.         病毒儲存6個月后，建議在使用前重新測定病毒滴度。

5.         若MOI值高于20時，建議感染增強劑使用體積為8μL/mL，提高轉染效率，一些特殊細胞不能加入感染增強劑。

6.         病毒添加量與待感染細胞MOI值、病毒滴度、目的基因產物對細胞毒性有關，病毒添加量計算方法滿足大多數實驗需要，實驗人員可在此基礎上摸索最佳病毒添加量。

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