Protein A/G瓊脂糖凝膠通常用于從(cong)血清、細胞(bao)培(pei)養上清或(huo)腹(fu)水(shui)中分(fen)離抗(kang)體，以(yi)及從(cong)細胞(bao)或(huo)組織提取物(wu)中分(fen)離抗(kang)原(yuan)進行免疫沉淀和免疫共(gong)沉淀。蛋(dan)白(bai)A/G瓊脂糖偶聯高質量的重組蛋(dan)白(bai)A/G，它可以(yi)結合(he)抗(kang)體的IgG結合(he)域,這些(xie)結構域可以(yi)與許多不同物(wu)種(zhong)的抗(kang)體結合(he)，包括小鼠、人、兔、豬(zhu)、狗和貓。

訂購信息

常溫運輸。4℃保存，有效期24個月。

技術參數

懸浮細胞樣品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收(shou)集細胞，棄上清。

2.用PBS 洗細胞一次，即用 PBS 將(jiang)細胞團重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。

3.用預冷的(de)IP Lysis/Wash Buffer重(zhong)懸細(xi)胞。每(mei)50mg 細(xi)胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時加入PMSF等相(xiang)應的(de)抑制劑，混(hun)勻后置于冰上靜置5-20 min（期間混(hun)勻幾次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min離(li)心收(shou)集上清(qing)液，置于冰上以備(bei)后續實驗（或置于-80 ℃長期保存）。

血清樣品

一般建(jian)議(yi)(yi)建(jian)議(yi)(yi)用(yong)IP Lysis/Wash Buffer稀(xi)釋(shi)血清樣品(pin)至(zhi)目(mu)標蛋(dan)白終濃度為50~150 µg/mL，置于(yu)冰上備(bei)用(yong)（或(huo)置于(yu)-20 ℃長期保存(cun)）。

免疫復合物的制備

【注】：樣品所需(xu)的量和孵育時間均依賴于每(mei)個特定的抗體(ti)-抗原體(ti)系，因(yin)而可能需(xu)要優化才能得到最(zui)大產量。

以(yi)下實驗方案針對2-10μg 親和純化的抗體，根據需(xu)要可以(yi)按(an)比例放大。

1.在離心管(guan)中，將每(mei)個樣(yang)品的細胞裂解液(ye)與2-10μg 免疫沉淀抗體結合。每(mei)個免疫沉淀反應(ying)推薦的總蛋白量(liang)為500-1500μg。

2.用IP Lysis/Wash Buffer將抗體以及制備好的樣(yang)品(pin)稀(xi)釋至(zhi)300-500μL。

3.在室溫下孵育(yu)1-2 h，或4 ℃過夜(ye)，以形成免疫復合物。

免疫沉淀

【注(zhu)】：為保證微(wei)球(qiu)均勻分(fen)布(bu)，使(shi)用前通過(guo)反復顛倒或輕微(wei)渦旋(xuan)混勻瓶中微(wei)球(qiu)。

1.將25µLProtein A/G瓊脂糖加入(ru)1.5 mL 離(li)心(xin)管中。

2.向離心管(guan)中加入500 µL 預冷PBS，輕柔混勻。

3.然后(hou)4℃、1000g離心5min,去除(chu)上清。

4.向離心(xin)管中加入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒(dao)離心(xin)管數(shu)次(ci)或輕(qing)微渦旋混(hun)勻1min。4℃、1000g離心(xin)5min,去除上清(qing)。

5.將抗(kang)原樣品(pin)/抗(kang)體混合(he)物加入裝有Protein A/G瓊脂(zhi)糖(tang)的離心管中，保持混勻(yun)室溫下孵育1-2 h，或4℃過夜(ye)。

6.4℃、1000g離(li)心5min，除去未(wei)結合的樣(yang)品，保存(cun)以(yi)備(bei)分析。

7.向離(li)心(xin)管(guan)中加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕(qing)柔混(hun)勻。4℃、1000g離(li)心(xin)5min收集(ji)瓊脂糖，棄上(shang)清。再重(zhong)復洗兩(liang)次。

8.向(xiang)離心(xin)管中加入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將樣品置于100℃水浴或者金(jin)屬(shu)浴中加熱10 min。離心(xin)后，保留含有目(mu)的抗原的上清。

注意事項

1.本產品僅限于科學實驗(yan)研究使用(yong)，不(bu)得用(yong)于臨床診(zhen)斷、治療等(deng)領域。

2.請(qing)勿高速離心(xin)、干燥或冷凍磁珠，這些(xie)操作會導(dao)致微球(qiu)聚集(ji)而降(jiang)低結合能力。

3.IP實驗(yan)(yan)(yan)中不同類型的抗(kang)(kang)體(ti)與抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)的親和性是有區別的，抗(kang)(kang)體(ti)與抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)還會受到IP Lysis/Wash Buffer的影響，因此，如(ru)使(shi)用本(ben)實驗(yan)(yan)(yan)步驟(zou)不能獲得最(zui)佳(jia)的實驗(yan)(yan)(yan)結(jie)果，可自行(xing)優化操作細(xi)節(jie)或(huo)者篩選及配制緩沖液進行(xing)實驗(yan)(yan)(yan)，推薦(jian)使(shi)用李(li)記生物的相關產品(pin)，參照相關產品(pin)推薦(jian)。

4.瓊脂糖(tang)使用前應(ying)充分振蕩(dang)均勻。瓊脂糖(tang)應(ying)保(bao)存(cun)在儲存(cun)溶液中，防止干燥。

附(fu)錄(lu)：蛋白(bai)A/G與不(bu)同(tong)種(zhong)類的Ig，s及其亞(ya)類的結合(he)強度

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