Anti-Flag瓊脂糖凝膠Anti-Flag Affinity Gel可以實現高(gao)效快速的(de)抗原分(fen)(fen)離。免(mian)疫(yi)(yi)沉淀(dian)(dian)試劑盒(he)配有經過優化預制(zhi)的(de)緩沖液(ye)，為免(mian)疫(yi)(yi)沉淀(dian)(dian)實驗提供了最(zui)佳的(de)反(fan)應條件(jian)，增強(qiang)了免(mian)疫(yi)(yi)沉淀(dian)(dian)實驗的(de)穩(wen)定性。本產(chan)品可廣(guang)泛應用于細(xi)胞(bao)裂解物(wu)、細(xi)胞(bao)分(fen)(fen)泌上(shang)清、血清、腹水等樣品中抗原的(de)免(mian)疫(yi)(yi)沉淀(dian)(dian)反(fan)應。

訂購信息

常溫運輸。4℃保存，有效期24個月。

技術參數

貼壁細胞樣品

1.移(yi)去培養基(ji)，用PBS洗細胞兩次(ci)。

2.收集(ji)細(xi)胞至(zhi)1.5 mLEP 管內，按比例加入(ru)IP Lysis/Wash Buffer，同時(shi)加入(ru)PMSF等相應的抑制劑，混勻后(hou)置(zhi)于冰(bing)上靜置(zhi)5-20 min（期間混勻幾次(ci)）。

3.4 ℃, 12000-16000 g,10 min離心收集(ji)上(shang)清液，置于(yu)冰上(shang)以備后續實(shi)驗(yan)（或置于(yu)-80 ℃長(chang)期(qi)保存(cun)）。

培養皿IP Lysis/Wash Buffer推薦(jian)使用體(ti)積：

懸浮細胞樣品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞(bao)，棄(qi)上清。

2.用PBS 洗細胞一(yi)次，即用PBS 將細胞團(tuan)重(zhong)懸，4℃、500-1000 g、10 min，收(shou)集細胞，棄上清。

3.用(yong)預(yu)冷的IP Lysis/Wash Buffer重懸細胞。每50 mg 細胞使(shi)用(yong)500μL IP Lysis/Wash Buffer。同(tong)時加入PMSF等相(xiang)應的抑制劑，混勻后(hou)置(zhi)于冰上靜置(zhi)5-20 min（期間混勻幾次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min離心(xin)收集上清(qing)液(ye)，置(zhi)于冰上以備后續實驗(yan)（或置(zhi)于-80 ℃長期保存(cun)）。

血清樣品

　一般(ban)建議(yi)建議(yi)用IP Lysis/Wash Buffer稀(xi)釋血清樣品至目標蛋(dan)白終濃度為50~150 µg/mL，置于冰上(shang)備用（或置于-20 ℃長(chang)期保存）。

免疫沉淀

【注】：為保證(zheng)凝膠均勻分布，使用前通過反(fan)復(fu)顛倒(dao)或輕(qing)微渦旋混勻瓶中(zhong)凝膠。

1.將25 µL的Anti-Flag Affinity Gel加入1.5 mL 離心管中。

2.向凝膠中加入500 µL 預冷(leng)PBS，輕柔混勻。

3.將離心管放入離心機中1000rpm，5min收集凝膠到(dao)離心管的底(di)部，去除上清。

4.向離心(xin)管中(zhong)加入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒離心(xin)管數次或輕(qing)微渦旋混勻(yun)1 min。將離心(xin)管放入離心(xin)機中(zhong)1000rpm，5min收集凝(ning)膠到(dao)離心(xin)管的底(di)部，去除上(shang)清。

5.將制(zhi)備好含(han)有(you)Flag標記蛋白(bai)的(de)樣品加(jia)入裝有(you)凝膠的(de)離(li)心管中，保(bao)持混勻室溫下孵育2-4 h。

6.離(li)心(xin)1000rpm，5min收集(ji)凝膠(jiao)，除去未(wei)結合的(de)樣品，保存(cun)以備分析。

7.向離心管中加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻(yun)。收集凝膠，棄上清。再(zai)重復洗兩(liang)次(ci)。

8.變性洗脫(tuo)：向離心管中加入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將樣品(pin)置于100℃水浴或(huo)者(zhe)金屬浴中加熱10 min。通(tong)過磁力架分離磁珠，保留含(han)有目的抗原的上清。

【注】：如需保持蛋(dan)白活性，也可采用以下洗脫方(fang)式。

低(di)pH洗(xi)脫：向離(li)心管中加(jia)入100 µL Elution Buffer。保持混勻在室(shi)溫下(xia)孵(fu)育(yu)離(li)心管5-10 min。通(tong)過離(li)心分離(li)凝膠，保留含有目的抗原的上清。每100 µL洗(xi)出(chu)液中加(jia)入20 µL Neutralization Buffer來(lai)中和低(di)pH。

注意事項

1.本(ben)產品僅限于(yu)科學實(shi)驗研究使用(yong)，不得用(yong)于(yu)臨床診斷、治(zhi)療等領(ling)域。

2.請(qing)勿高(gao)速離心、干燥或冷凍(dong)凝膠，這(zhe)些(xie)操作會導(dao)致凝膠聚集而降低結合能(neng)力。

3.IP實(shi)驗中不同(tong)類(lei)型的(de)(de)抗(kang)體與抗(kang)原結合的(de)(de)親和性(xing)是有(you)區別的(de)(de)，抗(kang)體與抗(kang)原結合還(huan)會受到(dao)IP Lysis/Wash Buffer的(de)(de)影響，因此，如使用(yong)本實(shi)驗步驟不能獲(huo)得最佳的(de)(de)實(shi)驗結果(guo)，可自行優化(hua)操作細(xi)節或(huo)者(zhe)篩選及配制緩沖(chong)液進(jin)行實(shi)驗，推薦使用(yong)李記生物的(de)(de)相關產(chan)品(pin)，參照相關產(chan)品(pin)推薦。

4.微球使用前應充分振蕩(dang)均勻(yun)。微球應保存(cun)在儲存(cun)溶液中，防止干燥(zao)。

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