Protein G瓊脂糖凝膠通常用于從血清、細胞(bao)培養(yang)上(shang)清或(huo)腹水(shui)中分離(li)抗體，以及從細胞(bao)或(huo)組(zu)織(zhi)提取物(wu)(wu)中分離(li)抗原進行免(mian)疫沉淀(dian)和免(mian)疫共(gong)沉淀(dian)。蛋白G瓊脂糖偶(ou)聯高質(zhi)量的(de)重組(zu)蛋白G，它可以結(jie)(jie)(jie)合抗體的(de)IgG結(jie)(jie)(jie)合域,這些(xie)結(jie)(jie)(jie)構(gou)域可以與許多(duo)不同物(wu)(wu)種的(de)抗體結(jie)(jie)(jie)合，包括小鼠、人(ren)、兔、豬、狗和貓。

訂購信息

常溫運輸。4℃保存，有效期24個月。

技術參數

懸浮細胞樣品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。

2.用PBS 洗細胞一次，即用 PBS 將(jiang)細胞團重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上(shang)清(qing)。

3.用預冷的(de)IP Lysis/Wash Buffer重懸細胞。每50mg 細胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時加入PMSF等相應的(de)抑制劑，混(hun)勻后置于冰(bing)上靜(jing)置5-20 min（期(qi)間混(hun)勻幾次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min離心收(shou)集上(shang)清液，置(zhi)于冰上(shang)以(yi)備后續實驗（或置(zhi)于-80 ℃長期(qi)保(bao)存）。

血清樣品

一般建議(yi)建議(yi)用IP Lysis/Wash Buffer稀(xi)釋血(xue)清樣品至(zhi)目(mu)標蛋白終濃度(du)為(wei)50~150 µg/mL，置于(yu)冰(bing)上備用（或置于(yu)-20 ℃長期(qi)保存）。

免疫復合物的制備

【注】：樣品所需(xu)的(de)量和孵育(yu)時間均依賴于每(mei)個(ge)特定的(de)抗體-抗原體系，因而(er)可能(neng)需(xu)要優化才能(neng)得到最(zui)大產量。

以下實驗方(fang)案針對2-10μg 親和純化的抗體，根據需要可以按比例放大。

1.在離心管(guan)中，將每個樣品的細胞(bao)裂解液與2-10μg 免疫沉淀抗體結合。每個免疫沉淀反(fan)應推薦(jian)的總蛋(dan)白量(liang)為500-1500μg。

2.用IP Lysis/Wash Buffer將抗體以及制(zhi)備好(hao)的樣品稀釋至300-500μL。

3.在室(shi)溫下孵育(yu)1-2 h，或4 ℃過(guo)夜，以形成免疫復合(he)物。

免疫沉淀

【注(zhu)】：為保證微球(qiu)均勻(yun)分布，使用(yong)前通過反(fan)復顛倒或輕微渦旋混勻(yun)瓶(ping)中微球(qiu)。

1.將25µLProtein G瓊脂(zhi)糖(tang)加(jia)入1.5 mL 離心(xin)管中(zhong)。

2.向離心管中加入500 µL 預冷PBS，輕柔(rou)混勻。

3.然后4℃、1000g離心(xin)5min,去除上清。

4.向(xiang)離心管中加入(ru)200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒離心管數次或輕微渦旋混勻1min。4℃、1000g離心5min,去除上(shang)清。

5.將抗原(yuan)樣品/抗體(ti)混合物加入裝(zhuang)有Protein G瓊(qiong)脂(zhi)糖的離心(xin)管中，保持混勻(yun)室溫下孵(fu)育1-2 h，或4℃過夜。

6.4℃、1000g離心5min，除去未結合的樣品，保存以備(bei)分析。

7.向(xiang)離心管(guan)中加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻。4℃、1000g離心5min收集瓊脂(zhi)糖，棄上清。再重復洗兩(liang)次。

8.向離心管中加(jia)入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將(jiang)樣品置于100℃水浴(yu)或(huo)者金屬浴(yu)中加(jia)熱(re)10 min。離心后，保留含有目的(de)抗(kang)原的(de)上清。

注意事項

1.本產(chan)品僅限(xian)于科學實驗研究使用，不得用于臨(lin)床診斷、治(zhi)療等領(ling)域。

2.請勿高速(su)離心、干燥(zao)或冷(leng)凍(dong)磁珠(zhu)，這些操(cao)作會(hui)導致微球聚集而降低結合(he)能(neng)力。

3.IP實(shi)(shi)驗(yan)中不同類型的抗(kang)(kang)體(ti)與抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)的親和性是有區(qu)別的，抗(kang)(kang)體(ti)與抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)還會受到IP Lysis/Wash Buffer的影(ying)響(xiang)，因此，如使用本實(shi)(shi)驗(yan)步驟不能獲得最佳的實(shi)(shi)驗(yan)結(jie)果，可自(zi)行(xing)優化操作細節或(huo)者篩選及(ji)配制緩沖液進行(xing)實(shi)(shi)驗(yan)，推薦使用李(li)記生物的相關(guan)產品，參照相關(guan)產品推薦。

4.瓊脂糖(tang)使用(yong)前(qian)應(ying)充分振蕩均勻。瓊脂糖(tang)應(ying)保存在儲存溶(rong)液(ye)中(zhong)，防(fang)止干燥。

附(fu)錄：蛋白(bai)G與不(bu)同種類的Ig，s及其亞類的結合強(qiang)度

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