Protein A瓊脂糖凝膠通常(chang)用于從血(xue)清(qing)、細胞培養(yang)上清(qing)或腹水(shui)中分(fen)離(li)抗(kang)體(ti)，以及從細胞或組織提取物中分(fen)離(li)抗(kang)原進(jin)行免疫沉(chen)淀和(he)免疫共(gong)沉(chen)淀。蛋白(bai)(bai)(bai)A瓊脂糖偶聯(lian)高質量的重組蛋白(bai)(bai)(bai)A，它(ta)可以結(jie)合(he)(he)抗(kang)體(ti)的IgG結(jie)合(he)(he)域。重組蛋白(bai)(bai)(bai)A含有5個的Fc結(jie)合(he)(he)結(jie)構域，這些結(jie)構域可以與許多不同物種(zhong)的抗(kang)體(ti)結(jie)合(he)(he)，包(bao)括小(xiao)鼠、人、兔、豬、狗(gou)和(he)貓(mao)。

訂購信息

常溫運輸。4℃保存，有效期24個月。

技術參數

懸浮細胞樣品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上(shang)清。

2.用(yong)(yong)PBS 洗(xi)細胞一次，即用(yong)(yong) PBS 將細胞團重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收集(ji)細胞，棄上(shang)清。

3.用預冷的IP Lysis/Wash Buffer重懸細(xi)胞。每50mg 細(xi)胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時加入PMSF等相應(ying)的抑制劑，混勻(yun)后置(zhi)(zhi)于冰上(shang)靜置(zhi)(zhi)5-20 min（期間混勻(yun)幾次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min離心收集上(shang)清(qing)液，置于(yu)冰上(shang)以備后續實驗（或(huo)置于(yu)-80 ℃長期保(bao)存）。

血清樣品

　一般建議(yi)建議(yi)用(yong)IP Lysis/Wash Buffer稀釋血清(qing)樣品至目標蛋白終濃(nong)度為(wei)50~150 µg/mL，置(zhi)(zhi)于冰(bing)上(shang)備用(yong)（或置(zhi)(zhi)于-20 ℃長期保存）。

免疫復合物的制備

【注】：樣品(pin)所需的(de)量和孵育時間均依賴于每個特(te)定(ding)的(de)抗體-抗原體系(xi)，因而可能需要優化(hua)才能得到最大產量。

　以下實驗方案針對(dui)2-10μg 親和純化的抗體，根據需要可以按比例放大。

1.在離心管(guan)中，將每個樣品的(de)細(xi)胞裂解(jie)液與2-10μg 免疫沉淀(dian)抗體(ti)結合。每個免疫沉淀(dian)反應推薦(jian)的(de)總蛋白量為500-1500μg。

2.用IP Lysis/Wash Buffer將抗體(ti)以及制(zhi)備好的樣品稀(xi)釋至300-500μL。

3.在室(shi)溫下孵育1-2 h，或(huo)4 ℃過(guo)夜，以(yi)形成免疫復合(he)物。

免疫沉淀

【注】：為保(bao)證微(wei)(wei)球均勻(yun)(yun)分布(bu)，使用前通過反(fan)復顛倒或(huo)輕微(wei)(wei)渦旋混勻(yun)(yun)瓶(ping)中(zhong)微(wei)(wei)球。

1.將25µLProtein A瓊脂糖加入1.5 mL 離心(xin)管(guan)中。

2.向離心管中加入500 µL 預冷PBS，輕柔(rou)混勻(yun)。

3.然(ran)后(hou)4℃、 1000g離心5min,去除(chu)上清。

4.向離心管中加(jia)入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒(dao)離心管數次或輕微渦旋混勻(yun)1min。4℃、1000g離心5min,去除上清。

5.將抗原樣(yang)品(pin)/抗體(ti)混(hun)合物(wu)加入裝有(you)Protein A瓊脂(zhi)糖(tang)的離心管中，保持混(hun)勻室溫下孵育1-2 h，或(huo)4℃過夜。

6.4℃、1000g離心(xin)5min，除去未結合的樣品，保存以備分析。

7.向離心管中加(jia)入500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻(yun)。4℃、1000g離心5min收集(ji)瓊脂(zhi)糖，棄上清。再重復洗兩次。

8.向(xiang)離心管中(zhong)(zhong)加入(ru)80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將樣品(pin)置于100℃水浴或者金(jin)屬浴中(zhong)(zhong)加熱10 min。離心后，保留含有目(mu)的抗原的上清。

注意事項

1.本產品僅限(xian)于(yu)科學(xue)實(shi)驗研究(jiu)使用(yong)，不得用(yong)于(yu)臨床診(zhen)斷、治(zhi)療等領域。

2.請勿高(gao)速離心(xin)、干燥或冷凍(dong)磁(ci)珠(zhu)，這(zhe)些(xie)操作(zuo)會(hui)導致微球聚集而降(jiang)低結合能(neng)力。

3.IP實驗中不同類(lei)型的(de)抗體與(yu)抗原結(jie)(jie)合(he)的(de)親和(he)性是(shi)有區(qu)別的(de)，抗體與(yu)抗原結(jie)(jie)合(he)還會受到(dao)IP Lysis/Wash Buffer的(de)影響(xiang)，因此(ci)，如使(shi)用本實驗步(bu)驟不能獲得最佳(jia)的(de)實驗結(jie)(jie)果(guo)，可自行(xing)優化操作細(xi)節或者(zhe)篩選(xuan)及配制緩(huan)沖(chong)液(ye)進行(xing)實驗，推薦使(shi)用李記生物的(de)相(xiang)(xiang)關(guan)產品，參照相(xiang)(xiang)關(guan)產品推薦。

4.瓊(qiong)脂(zhi)糖使(shi)用前(qian)應(ying)充分振(zhen)蕩(dang)均勻。瓊(qiong)脂(zhi)糖應(ying)保存在儲存溶液(ye)中，防(fang)止干燥。

附錄(lu)：蛋白A與不同種類的(de)Ig，s及其亞類的(de)結(jie)合強度(du)

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