EZ 488 TUNEL細胞凋亡(wang)檢測(ce)試劑盒(he)（綠色(se)熒光）

產品描述

細(xi)胞(bao)凋亡(wang)的一個顯著特點是細(xi)胞(bao)染色體 DNA 的(de)(de)(de)降(jiang)解(jie)，這是一(yi)個較普遍的(de)(de)(de)現(xian)象。這種降(jiang)解(jie)非(fei)常特(te)異(yi)并有(you)規律，所產生的(de)(de)(de)不同(tong)長度(du)的(de)(de)(de) DNA 片(pian)段(duan)約為(wei) 180 bp-200 bp 的(de)(de)(de)整數(shu)倍(bei)，表現(xian)為(wei)瓊(qiong)脂糖凝膠電(dian)泳中(zhong)呈(cheng)現(xian)特(te)異(yi)的(de)(de)(de)梯狀(zhuang) Ladder 圖譜，本(ben)試(shi)劑盒采用(yong) TUNEL 法，應用(yong)末端(duan)脫氧核(he)糖核(he)苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋(diao)亡(wang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)斷裂(lie)DNA 的(de)(de)(de)3′-OH末端(duan)催化摻(chan)入EZ 488-dUTP。EZ 488-dUTP標記的(de)(de)(de) DNA 可以用(yong)熒光顯微鏡直接(jie)觀察或(huo)者用(yong)流式細(xi)(xi)胞(bao)(bao)儀(yi)定量。TUNEL 法可以選擇性的(de)(de)(de)檢測(ce)凋(diao)亡(wang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，而非(fei)壞死細(xi)(xi)胞(bao)(bao)或(huo)因輻照和藥物治療(liao)而造成的(de)(de)(de) DNA 鏈斷裂(lie)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)。TUNEL 實驗中(zhong)， TdT 酶催化 dUTP 摻(chan)入斷裂(lie)的(de)(de)(de) DNA 鏈的(de)(de)(de)3′-OH末端(duan)。抗原標記的(de)(de)(de) dUTP（如digoxin-dUTP、生*素-dUTP），因為它可以直接進行原(yuan)位檢(jian)測(ce)，是一種更快速、直接的(de)檢(jian)測(ce)手段(duan)。

訂購信息

產品組(zu)分

運(yun)輸(shu)與(yu)保存

藍冰(bing)運輸。-20℃避光保存，有(you)效期24個(ge)月。【注】：避免(mian)反(fan)復凍融。

實(shi)驗(yan)材(cai)料(liao)（自備(bei)）

PBS緩沖液（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配制）

0.1% Triton X-100（PBS配制，其中(zhong)含5 mg/mL BSA）

4%多聚*醛（PBS配(pei)制）

免疫組化筆

脫蠟溶劑（石蠟切(qie)片樣(yang)本(ben)）

石(shi)蠟切片處理相關試(shi)劑(ji)

抗熒(ying)光淬滅封片劑

ddH₂O

使用方法

一、實驗設計

1. 陽性對照(zhao)（可選）：

　　DNase I處(chu)理制備陽(yang)性對(dui)照載玻片。DNase I可(ke)以消化單(dan)(dan)鏈(lian)或(huo)雙鏈(lian)DNA產生單(dan)(dan)脫氧(yang)(yang)核(he)苷酸或(huo)單(dan)(dan)鏈(lian)或(huo)雙鏈(lian)的寡脫氧(yang)(yang)核(he)苷酸的核(he)酸內切酶(mei)，人為造成細(xi)胞凋(diao)亡。

2. 陰性(xing)對照（可選）：

　　使用(yong)不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme。

3. 實驗(yan)處(chu)理組。

4. 實驗對照組。

二、實驗步驟

1. 樣本準備(bei)：

對于貼壁細(xi)(xi)胞(bao)或細(xi)(xi)胞(bao)涂片

（1）PBS清洗1次。【注】：如(ru)果擔心細(xi)(xi)胞涂片的(de)細(xi)(xi)胞貼得(de)不牢，可以干燥樣品使細(xi)(xi)胞貼得(de)更牢。

（2）固定：加入適量4%多(duo)聚*醛（PBS配制），室(shi)溫固定30 min。PBS清洗2次。

（3）通(tong)透(tou)：加入適量0.2% Triton X-100（PBS配制(zhi)），室溫(wen)通透20 min。PBS清洗2次(ci)。

（4）轉步(bu)驟2. TUNEL 反應。

對于懸浮(fu)細胞或細胞懸液

（1）收集(ji)細胞（ 3-5×10⁶個細胞(bao)），1000 rpm離心5 min，PBS清洗(xi)2次。

（2）固定：加入適量4%多聚*醛（PBS配制）充(chong)分重(zhong)懸(xuan)細胞，4℃固定30 min。2000 rpm離(li)心5 min，PBS清洗2次。

（3）通透：加入適量(liang)0.2% Triton X-100（PBS配制(zhi)），室溫(wen)通透20 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（4）轉步驟(zou)2. TUNEL 反應。

石蠟(la)組織切片

（1）脫蠟與水化：將(jiang)切片樣本依次(ci)放(fang)入二甲苯I（10 min）→ 二(er)甲苯II（10 min）→ 100％乙醇(chun)(chun)(chun)I（5 min）→ 100％乙醇(chun)(chun)(chun)II（5 min）→ 95%乙醇(chun)(chun)(chun)（5 min）→ 90%乙醇(chun)(chun)(chun)（5 min）→ 80%乙醇(chun)(chun)(chun)（5 min）→ 70%乙醇(chun)(chun)(chun)（5 min）→ ddH2O沖洗(xi)5 min，沖洗(xi)2次。【注】：二(er)甲苯有毒(du)，易揮發，請在通(tong)風櫥中(zhong)進行此操作。

（2）用(yong)濾紙吸(xi)干切片樣本周圍(wei)液體，用(yong)免疫組化筆圈好樣本輪(lun)廓，以便(bian)下游(you)通(tong)透與標記。

注：若在后續實驗操(cao)作中發(fa)現免疫組化筆畫的輪廓圈(quan)被破壞，需(xu)及(ji)時補(bu)畫。

（3）通透：按1: 100的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液(ye)用PBS稀釋(shi)至終濃度20 µg/mL，在每個(ge)樣本(ben)(ben)上滴加(jia)100 µL，使溶液(ye)覆蓋全部樣本(ben)(ben)區域(yu)，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可通透細(xi)胞膜和核(he)膜，從而(er)使后續步驟的(de)(de)染色(se)試劑(ji)充分進(jin)入細(xi)胞核(he)進(jin)行(xing)(xing)反應，提高標記效(xiao)率(lv)。孵育時間過(guo)(guo)長會增加組織切片(pian)在后續洗滌步驟中(zhong)從載(zai)波片(pian)上脫落的(de)(de)風(feng)險，過(guo)(guo)短則可能(neng)造成透性處理不(bu)充分，影(ying)響標記效(xiao)率(lv)。為得到(dao)更好的(de)(de)結果，Proteinase K的(de)(de)濃(nong)度(du)、孵育時間、溫度(du)需根據不(bu)同類型組織樣本進(jin)行(xing)(xing)優化。

（4）PBS漂洗切片2次，每次5 min，用濾(lv)紙吸去多余的液(ye)體，將(jiang)處理好(hao)的樣(yang)本放在濕盒中保(bao)持(chi)濕潤。

注：這(zhe)一步(bu)必須把Proteinase K洗(xi)滌(di)干(gan)凈，否則會嚴重干(gan)擾(rao)后續的標記反應。

（5）轉步驟(zou)2. TUNEL 反應。

冰凍組織切片

（1）固(gu)定：取出冰(bing)凍切片，并回溫至室溫。加入適(shi)量4%多聚*醛（PBS配制(zhi)），室溫固定30 min。PBS漂洗2次，每(mei)次10 min。【注】：若是擔(dan)心甲(jia)醛(quan)清洗(xi)不干凈，影響最終染色效果。可(ke)在(zai)甲(jia)醛(quan)固定完成(cheng)后加(jia)入適量2 mg/mL 甘(gan)*酸清洗 10 min，中和殘留的固(gu)定(ding)液，再進行(xing)PBS清洗(xi)。

（2）用濾紙吸干切(qie)片樣(yang)本周圍(wei)液(ye)體，用免疫組化筆(bi)圈好(hao)樣(yang)本輪廓，以便下游通(tong)透與(yu)標記(ji)。

注：若(ruo)在后續實驗操作中發(fa)現免疫組(zu)化筆畫的輪廓圈(quan)被破(po)壞，需及時(shi)補畫。

（3）通透：按1: 100的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液(ye)用PBS稀釋至終濃度20 µg/mL，在(zai)每個(ge)樣(yang)本上(shang)滴(di)加100 µL，使溶液(ye)覆蓋全部樣(yang)本區域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可(ke)通(tong)透細胞膜(mo)和核膜(mo)，從而使后續步(bu)驟的染(ran)色試劑充分(fen)進入細胞核進行反(fan)應，提高標記(ji)效率(lv)。孵育時(shi)間(jian)過(guo)長會(hui)增加組(zu)(zu)織(zhi)切片(pian)在后續洗滌步(bu)驟中從載波(bo)片(pian)上脫落的風(feng)險，過(guo)短則可(ke)能造成(cheng)透性處理不(bu)充分(fen)，影響標記(ji)效率(lv)。為得(de)到更(geng)好的結(jie)果(guo)，Proteinase K的濃度、孵育時(shi)間(jian)、溫度需(xu)根據不(bu)同類(lei)型組(zu)(zu)織(zhi)樣本進行優(you)化。

（4）PBS漂洗切(qie)片(pian)2次(ci)，每次(ci)5 min，用濾(lv)紙吸(xi)去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中(zhong)保持濕潤。【注】：這一步必須把(ba)Proteinase K洗滌(di)干(gan)凈，否(fou)則(ze)會嚴重干(gan)擾后(hou)續的標記反應。

（5）轉步(bu)驟2. TUNEL 反應。

陽(yang)性處理（僅陽(yang)性對照進(jin)行(xing)此步驟，其他樣(yang)品直(zhi)接進(jin)行(xing)TUNEL反應(ying)步驟(zou)）

（1）按1: 10的比例(li)用ddH2O將(jiang)10× DNase I Buffer稀釋成1× DNase I Buffer備用。

（2）滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已(yi)處理(li)的樣(yang)本上，覆蓋全部樣(yang)本區域，室(shi)溫平(ping)衡5 min。

（3）用(yong)1× DNase I Buffer以(yi)1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工(gong)作液。

（4）棄(qi)去Buffer，加入(ru)100 μL濃(nong)度為20 U/mL的 DNase I工作液，室(shi)溫孵育10 min。

（5）棄去DNase I工(gong)作(zuo)液(ye)，PBS清洗2次(ci)。

（6）轉步(bu)驟2. TUNEL 反應(ying)。

2. TUNEL 反(fan)應

配制TUNEL反應液(ye)（即用即配）：

對于貼壁細胞、細胞涂(tu)片或組織(zhi)切片

（1）每個(ge)樣本加入50 μL TUNEL反應(ying)液，使反應(ying)液均勻(yun)覆(fu)蓋樣本。37℃避(bi)光孵育適宜的時(shi)間(jian)（細胞推(tui)(tui)薦染色(se)時(shi)間(jian)30min-1h，組織染色(se)時(shi)間(jian)推(tui)(tui)薦2h）。【注】：50 μL TUNEL反(fan)應(ying)液(ye)適合涂(tu)(tu)片(pian)、切(qie)(qie)片(pian)或(huo)(huo)96孔(kong)板(ban)（其(qi)他不同孔(kong)板(ban)可(ke)以(yi)適當調整(zheng)TUNEL反(fan)應(ying)液(ye)體積，覆蓋(gai)細胞即(ji)可(ke)）。如果待(dai)檢測的樣(yang)品為涂(tu)(tu)片(pian)、切(qie)(qie)片(pian)或(huo)(huo)在24孔(kong)板(ban)、12孔(kong)板(ban)或(huo)(huo)6孔(kong)板(ban)中(zhong)，可(ke)以(yi)使(shi)(shi)用(yong)(yong)防(fang)蒸發膜，或(huo)(huo)自行嘗試使(shi)(shi)用(yong)(yong)自封袋或(huo)(huo)者其(qi)它適當材料自行裁剪(jian)成比孔(kong)略小的圓形塑料片(pian)，滴加TUNEL反(fan)應(ying)液(ye)后覆蓋(gai)在樣(yang)品上，可(ke)以(yi)防(fang)止TUNEL反(fan)應(ying)液(ye)蒸發，并且使(shi)(shi)TUNEL反(fan)應(ying)液(ye)均勻覆蓋(gai)樣(yang)本。

（2）棄去TUNEL 反應液(ye)，PBS漂洗2次，每(mei)次5 min。【注】：為了降(jiang)低背景，PBS漂洗(xi)切片1次后，可再用0.1% Triton X-100（PBS配(pei)制，其中含5 mg/mL BSA）漂洗(xi)3次，每(mei)次 5 min，這樣(yang)游離的(de)未反應(ying)的(de)標記物可以清除較干凈(jing)。

（3）（可選）每個樣本加入適量濃度(du)為5 μg/mL 的DAPI染液，室溫避(bi)光孵育5 min。染色完(wan)成(cheng)后(hou)，棄去DAPI染液，PBS漂洗2次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)5 min。

（4）（可選）切片(pian)封(feng)片(pian)：將切片(pian)依次(ci)在純(chun)水、70%乙(yi)醇(chun)(chun)、80%乙(yi)醇(chun)(chun)、90%乙(yi)醇(chun)(chun)、95%乙(yi)醇(chun)(chun)、無水(shui)乙(yi)醇(chun)(chun)中(zhong)浸(jin)沒5 min，最后將切(qie)片(pian)(pian)樣本置于染(ran)(ran)色缸(gang)中(zhong)以新(xin)鮮(xian)的(de)二甲苯浸(jin)泡，透明化(hua)處理2次，每次5 min。脫水(shui)完(wan)成后，擦(ca)去切(qie)片(pian)(pian)周圍的(de)液體，每個樣本滴加50 μL抗熒光淬滅封片(pian)(pian)劑（抗熒光淬滅封片(pian)(pian)劑可(ke)能(neng)會不(bu)適用(yong)于某些染(ran)(ran)料，實驗(yan)前(qian)建議進(jin)行預實驗(yan)測試匹配性），蓋上(shang)蓋玻(bo)片(pian)(pian)，用(yong)鑷子的(de)鈍端(duan)輕(qing)輕(qing)敲擊蓋玻(bo)片(pian)(pian)，去除氣泡以使(shi)封片(pian)(pian)。

（5）用濾紙吸去多(duo)余的(de)液體，向樣(yang)本區域加100 μL PBS保持樣(yang)本濕潤(run)，立(li)即在熒光顯(xian)微鏡(jing)下觀察。

對于懸浮細胞(bao)或細胞(bao)懸液(ye)

（1）每個(ge)樣本管加入50 μL TUNEL反應液(ye)輕輕重懸細胞(bao)，37℃避光孵育30~60 min。每隔15 min用微量移液(ye)器輕輕重懸細胞(bao)。

（2）2000 rpm 離心(xin)5 min，棄(qi)去TUNEL 反應液(ye)，加入適量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中(zhong)含5 mg/mL BSA）輕輕重(zhong)懸細胞，并清洗2次。

（3）每(mei)個樣本管加(jia)入(ru)100 μL濃(nong)度為5 μg/mL的DAPI染液(ye)，室溫避(bi)光孵育5 min。

（4）加入400 μL PBS重懸細(xi)胞，立即用(yong)流式細(xi)胞儀檢測(ce)或進行(xing)涂片后(hou)在(zai)熒光顯微(wei)鏡下觀察。

注意事項

1. 本產品僅限(xian)于科(ke)學實驗研究使用，不得用于臨(lin)床診斷、治療等領(ling)域。

2. 使用前請(qing)將產品瞬時(shi)離心(xin)至管(guan)底，再進行(xing)后(hou)續(xu)實驗。

3. 染(ran)色(se)背(bei)景(jing)較重(zhong)或非(fei)特異性著色(se)明顯時可適當減少染(ran)色(se)時間(jian)。

4. 實驗(yan)時建議增(zeng)加陰性對照和(he)陽(yang)性對照組。

5. 組分A使用(yong)時請(qing)佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請(qing)立即(ji)用(yong)大(da)量(liang)水沖(chong)洗。

6. 熒光(guang)染(ran)料均存在(zai)淬(cui)滅問題，請盡(jin)量(liang)注意(yi)避光(guang)，以減緩熒光(guang)淬(cui)滅。

7. 為了您的安(an)全和健康，請穿實驗服并戴一(yi)次性手套(tao)操作(zuo)。

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