EZ 555 TUNEL細(xi)胞(bao)凋亡檢測試劑(ji)盒（橙紅熒光）

產品描述

細胞凋亡(wang)的一個顯(xian)著特點是細胞染色體 DNA 的(de)(de)(de)(de)降解，這是一個(ge)較普(pu)遍的(de)(de)(de)(de)現象(xiang)。這種(zhong)降解非常特(te)異并(bing)有(you)規律(lv)，所產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)不(bu)同長度的(de)(de)(de)(de) DNA 片段(duan)約為(wei) 180 bp-200 bp 的(de)(de)(de)(de)整數倍，表現為(wei)瓊脂糖凝膠電泳中呈現特(te)異的(de)(de)(de)(de)梯狀 Ladder 圖譜，本試(shi)劑(ji)盒采用(yong) TUNEL 法(fa)，應用(yong)末(mo)端(duan)脫氧核糖核苷酸(suan)轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細胞斷裂DNA 的(de)(de)(de)(de)3′-OH 末(mo)端(duan)催化摻入EZ 555-dUTP。EZ 555-dUTP標記的(de)(de)(de)(de) DNA 可以用(yong)熒光(guang)顯微鏡直接觀察(cha)或(huo)者用(yong)流(liu)式細胞儀定(ding)量。 TUNEL法(fa)可以選(xuan)擇(ze)性的(de)(de)(de)(de)檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或(huo)因輻照和藥(yao)物治療而造成的(de)(de)(de)(de) DNA 鏈斷裂的(de)(de)(de)(de)細胞。TUNEL 實驗中， TdT 酶催化 dUTP 摻入斷裂的(de)(de)(de)(de) DNA 鏈的(de)(de)(de)(de)3′-OH末(mo)端(duan)。抗原(yuan)標記的(de)(de)(de)(de) dUTP（如(ru)digoxin-dUTP、生*素-dUTP），因(yin)為它可以直接(jie)進行原(yuan)位(wei)檢測(ce)，是(shi)一(yi)種更快速、直接(jie)的檢測(ce)手(shou)段。

訂購信息

產品組分(fen)

運輸(shu)與(yu)保存

藍冰運輸(shu)。-20℃避光保存(cun)，有(you)效期24個月(yue)。【注】：避免(mian)反復凍融。

實驗材(cai)料（自備）

PBS緩沖液(ye)（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配制）

0.1% Triton X-100（PBS配(pei)制，其(qi)中(zhong)含5 mg/mL BSA）

4%多(duo)**醛（PBS配(pei)制）

免疫組化筆

脫蠟溶劑（石蠟切片(pian)樣(yang)本(ben)）

石(shi)蠟切片處理相(xiang)關試劑(ji)

抗熒光(guang)淬滅(mie)封片劑

ddH₂O

使(shi)用方法(fa)

一(yi)、實驗(yan)設計

1. 陽(yang)性(xing)對照（可選）：

　　DNase I處理制(zhi)備陽性(xing)對照載玻片(pian)。DNase I可(ke)以消化(hua)單(dan)鏈或雙(shuang)鏈DNA產生單(dan)脫氧(yang)核(he)苷酸或單(dan)鏈或雙(shuang)鏈的寡(gua)脫氧(yang)核(he)苷酸的核(he)酸內切(qie)酶，人為造成細胞凋(diao)亡。

2. 陰性對照(zhao)（可選）：

　　使用不(bu)含(han)TdT Enzyme的(de)TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme。

3. 實驗處理組。

4. 實驗對照組。

二、實驗步(bu)驟(zou)

1. 樣(yang)本(ben)準備：

對于貼壁細(xi)胞或細(xi)胞涂(tu)片(pian)

（1）PBS清洗1次。【注】：如果擔心細胞(bao)涂(tu)片的細胞(bao)貼得(de)不牢(lao)，可以(yi)干(gan)燥樣(yang)品使(shi)細胞(bao)貼得(de)更牢(lao)。

（2）固定：加入(ru)適量4%多**醛（PBS配(pei)制），室溫(wen)固(gu)定30 min。PBS清洗2次。

（3）通透：加(jia)入適量(liang)0.2% Triton X-100（PBS配制），室溫(wen)通透20 min。PBS清洗2次。

（4）轉(zhuan)步(bu)驟2. TUNEL 反應。

對(dui)于懸浮細(xi)胞(bao)(bao)或細(xi)胞(bao)(bao)懸液

（1）收集細胞（ 3-5×10⁶個細胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（2）固定(ding)：加(jia)入適量4%多**醛(quan)（PBS配制）充(chong)分重(zhong)懸細胞，4℃固定30 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次(ci)。

（3）通透：加入適量0.2% Triton X-100（PBS配(pei)制(zhi)），室溫通透20 min。2000 rpm離心5 min，PBS清(qing)洗2次。

（4）轉(zhuan)步(bu)驟2. TUNEL 反應。

石蠟(la)組織切片(pian)

（1）脫蠟與水(shui)化：將切片樣本依(yi)次放入二甲苯(ben)I（10 min）→ 二甲苯(ben)II（10 min）→ 100％乙(yi)醇(chun)(chun)I（5 min）→ 100％乙(yi)醇(chun)(chun)II（5 min）→ 95%乙(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ 90%乙(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ 80%乙(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ 70%乙(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ ddH2O沖洗5 min，沖洗2次。【注】：二甲苯(ben)有毒，易(yi)揮(hui)發，請在(zai)通風櫥(chu)中進行此(ci)操(cao)作。

（2）用(yong)濾紙吸干切片樣本周圍(wei)液體，用(yong)免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。

注(zhu)：若在后續實驗(yan)操作中(zhong)發現免疫(yi)組化筆畫的輪廓(kuo)圈被(bei)破壞，需及時補畫。

（3）通(tong)透：按1: 100的(de)(de)比例，將2 mg/mL的(de)(de)Proteinase K溶(rong)液(ye)(ye)用(yong)PBS稀釋至(zhi)終(zhong)濃度20 µg/mL，在每個樣(yang)本(ben)上滴加(jia)100 µL，使溶(rong)液(ye)(ye)覆蓋全部樣(yang)本(ben)區域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可(ke)通透細胞膜(mo)和核膜(mo)，從而使(shi)后(hou)續步驟的(de)染色試劑充分進(jin)入細胞核進(jin)行反(fan)應，提高標記(ji)效率。孵育(yu)時(shi)間過(guo)長(chang)會增加組織切片(pian)(pian)在后(hou)續洗滌步驟中從載波片(pian)(pian)上脫落的(de)風險，過(guo)短(duan)則可(ke)能造成透性處理不充分，影(ying)響標記(ji)效率。為得到(dao)更(geng)好的(de)結果，Proteinase K的(de)濃度、孵育(yu)時(shi)間、溫度需根(gen)據(ju)不同類型(xing)組織樣本進(jin)行優化。

（4）PBS漂洗切片2次，每次5 min，用濾(lv)紙(zhi)吸(xi)去多余的液體(ti)，將處理好的樣本放(fang)在濕盒中保持濕潤。

注(zhu)：這一步必須(xu)把Proteinase K洗滌干(gan)凈，否則會嚴重干(gan)擾后續的標記反應。

（5）轉(zhuan)步驟2. TUNEL 反應。

冰凍組織(zhi)切片

（1）固定：取出冰凍(dong)切片，并(bing)回溫至(zhi)室溫。加入適量4%多**醛（PBS配(pei)制），室(shi)溫(wen)固定30 min。PBS漂洗(xi)2次，每次10 min。【注】：若是擔心甲醛(quan)(quan)清洗不干凈，影響(xiang)最終染色效果。可在甲醛(quan)(quan)固(gu)定完成后加入(ru)適量2 mg/mL 甘*酸清洗 10 min，中和(he)殘(can)留的(de)固定液，再進行(xing)PBS清洗(xi)。

（2）用濾紙吸(xi)干切片樣本周圍(wei)液(ye)體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。

注：若在后續實驗操作中發現免疫組化筆畫的(de)輪廓(kuo)圈被(bei)破壞，需及(ji)時補畫。

（3）通透：按1: 100的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶(rong)(rong)液(ye)用PBS稀釋至終濃度(du)20 µg/mL，在每個樣本上滴加100 µL，使溶(rong)(rong)液(ye)覆蓋全(quan)部樣本區域，20-37℃孵(fu)育(yu)20 min。【注】：Proteinase K可通透細胞膜和核膜，從而使后(hou)續步驟的染色試劑充(chong)分(fen)進(jin)入細胞核進(jin)行反應，提高標記(ji)效率。孵育時間過長會增加組(zu)織切(qie)片(pian)(pian)在后(hou)續洗滌步驟中從載(zai)波片(pian)(pian)上脫落的風險(xian)，過短則(ze)可能造成透性處理不充(chong)分(fen)，影響標記(ji)效率。為(wei)得(de)到(dao)更好的結果，Proteinase K的濃度(du)、孵育時間、溫度(du)需根據不同類型組(zu)織樣本進(jin)行優化。

（4）PBS漂洗(xi)切(qie)片2次(ci)，每次(ci)5 min，用濾(lv)紙吸去多余的(de)液(ye)體，將(jiang)處理好的(de)樣本放在濕盒中保持濕潤。【注】：這一步必須把Proteinase K洗滌(di)干(gan)(gan)凈(jing)，否則會嚴重干(gan)(gan)擾(rao)后續的標記(ji)反應。

（5）轉步驟2. TUNEL 反應(ying)。

陽性(xing)(xing)處(chu)理（僅陽性(xing)(xing)對照進行此步驟，其他樣品直接進行TUNEL反應步驟）

（1）按1: 10的比例用ddH2O將10× DNase I Buffer稀釋成(cheng)1× DNase I Buffer備用。

（2）滴加(jia)100 µL 1× DNase I Buffer到已處理的樣本(ben)上，覆蓋全(quan)部(bu)樣本(ben)區域(yu)，室溫平衡5 min。

（3）用1× DNase I Buffer以1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工作液。

（4）棄(qi)去Buffer，加入100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液，室溫孵(fu)育10 min。

（5）棄去DNase I工作液，PBS清(qing)洗(xi)2次。

（6）轉步驟(zou)2. TUNEL 反應。

2. TUNEL 反應

配制TUNEL反應液（即(ji)用(yong)即(ji)配）：

對于(yu)貼(tie)壁細(xi)胞(bao)、細(xi)胞(bao)涂(tu)片或組(zu)織切片

（1）每個樣本加(jia)入50 μL TUNEL反應(ying)液(ye)，使反應(ying)液(ye)均勻(yun)覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜(yi)的時(shi)間(jian)（細胞推(tui)(tui)薦染色時(shi)間(jian)30min-1h，組織染色時(shi)間(jian)推(tui)(tui)薦2h）。【注】：50 μL TUNEL反(fan)(fan)應(ying)(ying)液適合涂片(pian)(pian)(pian)、切片(pian)(pian)(pian)或96孔(kong)板(ban)（其他不同孔(kong)板(ban)可(ke)以(yi)適當(dang)調(diao)整TUNEL反(fan)(fan)應(ying)(ying)液體積，覆蓋(gai)(gai)(gai)細胞即可(ke)）。如果(guo)待(dai)檢(jian)測的樣(yang)品(pin)為涂片(pian)(pian)(pian)、切片(pian)(pian)(pian)或在24孔(kong)板(ban)、12孔(kong)板(ban)或6孔(kong)板(ban)中，可(ke)以(yi)使用防(fang)蒸發膜，或自行嘗試(shi)使用自封袋或者其它(ta)適當(dang)材料自行裁剪成比孔(kong)略小的圓形塑料片(pian)(pian)(pian)，滴加TUNEL反(fan)(fan)應(ying)(ying)液后覆蓋(gai)(gai)(gai)在樣(yang)品(pin)上，可(ke)以(yi)防(fang)止(zhi)TUNEL反(fan)(fan)應(ying)(ying)液蒸發，并(bing)且(qie)使TUNEL反(fan)(fan)應(ying)(ying)液均勻覆蓋(gai)(gai)(gai)樣(yang)本。

（2）棄(qi)去(qu)TUNEL 反應液，PBS漂洗2次，每(mei)次5 min。【注】：為了(le)降低背(bei)景，PBS漂(piao)洗切(qie)片1次(ci)后，可(ke)再用(yong)0.1% Triton X-100（PBS配(pei)制，其(qi)中含5 mg/mL BSA）漂(piao)洗3次(ci)，每(mei)次(ci) 5 min，這(zhe)樣游(you)離(li)的(de)未反應的(de)標記(ji)物可(ke)以(yi)清除較干凈。

（3）（可選）每個樣(yang)本加入適量(liang)濃度(du)為(wei)5 μg/mL 的DAPI染液，室溫避光(guang)孵育5 min。染色完成后，棄(qi)去DAPI染液，PBS漂(piao)洗2次，每次5 min。

（4）（可選）切(qie)片(pian)封片(pian)：將切(qie)片(pian)依次在純水、70%乙(yi)醇(chun)、80%乙(yi)醇(chun)、90%乙(yi)醇(chun)、95%乙(yi)醇(chun)、無水乙(yi)醇(chun)中(zhong)浸沒5 min，最后(hou)將切(qie)片樣本(ben)置于染色(se)缸中(zhong)以(yi)新鮮(xian)的(de)二甲苯浸泡，透明化處理(li)2次，每次5 min。脫水完(wan)成(cheng)后(hou)，擦去切(qie)片周(zhou)圍的(de)液(ye)體，每個樣本(ben)滴(di)加50 μL抗熒(ying)光(guang)淬(cui)滅封(feng)片劑（抗熒(ying)光(guang)淬(cui)滅封(feng)片劑可能會(hui)不適用于某些染料，實(shi)驗前建議(yi)進行(xing)預(yu)實(shi)驗測試(shi)匹配性），蓋(gai)上蓋(gai)玻片，用鑷(nie)子的(de)鈍(dun)端輕輕敲擊蓋(gai)玻片，去除氣泡以(yi)使封(feng)片。

（5）用(yong)濾紙吸去(qu)多余的液體，向(xiang)樣(yang)本區(qu)域加100 μL PBS保持樣本濕潤，立即在熒(ying)光顯微(wei)鏡下觀察。

對于(yu)懸(xuan)浮(fu)細胞或細胞懸(xuan)液

（1）每個樣本(ben)管加入(ru)50 μL TUNEL反(fan)應液輕輕重(zhong)懸(xuan)細胞，37℃避光孵(fu)育30~60 min。每隔15 min用(yong)微量(liang)移液器輕輕重(zhong)懸(xuan)細胞。

（2）2000 rpm 離心5 min，棄去TUNEL 反應液(ye)，加入適量0.1% Triton X-100（PBS配(pei)制(zhi)，其中含5 mg/mL BSA）輕輕重懸細胞，并清洗2次。

（3）每個樣本管加入100 μL濃度為5 μg/mL的DAPI染液(ye)，室溫避光孵育5 min。

（4）加入400 μL PBS重(zhong)懸(xuan)細胞(bao)，立(li)即用流式細胞(bao)儀檢(jian)測(ce)或進行涂片后在熒(ying)光顯微鏡下(xia)觀察。

注意事項(xiang)

1. 本產品僅限于科(ke)學實驗研究使用，不得用于臨(lin)床診斷(duan)、治療等領域。

2. 使用前請將產品瞬時離心(xin)至管底，再進行后續實驗。

3. 染色(se)背景較重或非(fei)特(te)異性著色(se)明(ming)顯時可適(shi)當減少(shao)染色(se)時間(jian)。

4. 實驗時(shi)建議增(zeng)加陰(yin)性對照(zhao)和(he)陽性對照(zhao)組。

5. 組分(fen)A使(shi)用(yong)時請佩戴口罩、手(shou)套，如接觸(chu)皮膚，請立即用(yong)大(da)量水(shui)沖洗(xi)。

6. 熒光(guang)染(ran)料均存(cun)在淬滅(mie)問題，請盡(jin)量(liang)注(zhu)意避光(guang)，以減緩熒光(guang)淬滅(mie)。

7. 為(wei)了(le)您的安(an)全和健康，請穿(chuan)實驗(yan)服并(bing)戴一次性手套操作。

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