EZ 594 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（紅色熒光）

產品描(miao)述

細胞凋(diao)亡的一(yi)個顯著特(te)點(dian)是細胞染色體(ti) DNA 的(de)(de)(de)降解，這是一(yi)個較普遍的(de)(de)(de)現(xian)象。這種(zhong)降解非常特異并有(you)規律，所產生的(de)(de)(de)不同長度的(de)(de)(de) DNA 片段約為 180 bp-200 bp 的(de)(de)(de)整數倍(bei)，表現(xian)為瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠電泳中呈現(xian)特異的(de)(de)(de)梯(ti)狀 Ladder 圖譜，本試劑(ji)盒采用 TUNEL 法，應用末端(duan)脫氧核糖核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細(xi)胞(bao)(bao)斷裂(lie)DNA 的(de)(de)(de)3′-OH 末端(duan)催化(hua)摻入(ru)EZ 594-dUTP。EZ 594-dUTP標(biao)記的(de)(de)(de) DNA 可以(yi)用熒光顯(xian)微鏡直(zhi)接觀察或者用流式細(xi)胞(bao)(bao)儀定量。 TUNEL法可以(yi)選(xuan)擇性的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)凋亡細(xi)胞(bao)(bao)， 而非壞死細(xi)胞(bao)(bao)或因(yin)輻照(zhao)和藥物治療而造(zao)成的(de)(de)(de) DNA 鏈斷裂(lie)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)。TUNEL 實驗(yan)中， TdT 酶催化(hua) dUTP 摻入(ru)斷裂(lie)的(de)(de)(de) DNA 鏈的(de)(de)(de)3′-OH末端(duan)。抗(kang)原(yuan)標(biao)記的(de)(de)(de) dUTP（如(ru)digoxin-dUTP、生(sheng)*素(su)-dUTP），因為它(ta)可以(yi)直接進行原位檢(jian)測，是一種更快速(su)、直接的檢(jian)測手段。

訂購信息

產品組分

運輸與保存

藍(lan)冰運輸。-20℃避(bi)光保(bao)存，有效期24個月。【注】：避免反復凍融。

實(shi)驗材料（自備(bei)）

PBS緩沖液（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配制）

0.1% Triton X-100（PBS配(pei)制，其中含5 mg/mL BSA）

4%多**醛（PBS配(pei)制）

免疫組化筆

脫蠟(la)溶劑（石蠟(la)切(qie)片樣本(ben)）

石蠟(la)切片處(chu)理相關試(shi)劑

抗(kang)熒光(guang)淬滅封片劑(ji)

ddH₂O

使用方(fang)法

一、實驗設計

1. 陽性對照(zhao)（可選）：

　　DNase I處理制備陽性(xing)對照(zhao)載玻(bo)片。DNase I可以消化單(dan)鏈(lian)或(huo)雙(shuang)鏈(lian)DNA產生單(dan)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核苷酸(suan)或(huo)單(dan)鏈(lian)或(huo)雙(shuang)鏈(lian)的(de)寡脫(tuo)(tuo)氧(yang)核苷酸(suan)的(de)核酸(suan)內切酶(mei)，人為(wei)造成細胞凋亡。

2. 陰性對照（可選(xuan)）：

　　使用不含TdT Enzyme的(de)TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme。

3. 實驗處理組(zu)。

4. 實(shi)驗(yan)對(dui)照組。

二、實驗步驟

1. 樣本準備：

對于貼壁細胞或(huo)細胞涂(tu)片(pian)

（1）PBS清洗1次。【注】：如(ru)果擔心細胞(bao)(bao)涂(tu)片的(de)細胞(bao)(bao)貼得(de)不(bu)牢(lao)(lao)，可以干燥樣品(pin)使細胞(bao)(bao)貼得(de)更牢(lao)(lao)。

（2）固(gu)定：加入(ru)適量4%多**醛（PBS配制），室溫固(gu)定30 min。PBS清洗2次(ci)。

（3）通(tong)透：加入適量0.2% Triton X-100（PBS配制），室溫通透20 min。PBS清洗2次。

（4）轉步驟2. TUNEL 反應。

對(dui)于懸浮細胞或細胞懸液

（1）收(shou)集細(xi)胞（ 3-5×10⁶個細胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗(xi)2次。

（2）固定(ding)：加(jia)入適量4%多**醛（PBS配制）充分重懸細胞，4℃固定30 min。2000 rpm離(li)心5 min，PBS清(qing)洗2次。

（3）通透(tou)：加(jia)入適(shi)量0.2% Triton X-100（PBS配(pei)制(zhi)），室溫(wen)通透20 min。2000 rpm離(li)心5 min，PBS清(qing)洗2次。

（4）轉步驟2. TUNEL 反應(ying)。

石蠟組織切(qie)片

（1）脫蠟(la)與水(shui)化：將切片樣本依(yi)次放入二甲苯(ben)I（10 min）→ 二甲苯II（10 min）→ 100％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)I（5 min）→ 100％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)II（5 min）→ 95%乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ 90%乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ 80%乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ 70%乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)（5 min）→ ddH2O沖洗(xi)5 min，沖洗(xi)2次。【注(zhu)】：二甲苯有毒(du)，易揮發(fa)，請(qing)在通風櫥中進行此操作。

（2）用濾紙吸干切片樣本周圍(wei)液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以(yi)便下(xia)游通透與標記(ji)。

注：若在后(hou)續實驗操作(zuo)中(zhong)發現(xian)免疫(yi)組化筆畫的(de)輪廓(kuo)圈(quan)被破壞，需及時補畫。

（3）通透：按1: 100的(de)比例，將2 mg/mL的(de)Proteinase K溶(rong)液用PBS稀釋(shi)至終濃度20 µg/mL，在(zai)每個樣本上(shang)滴(di)加100 µL，使溶(rong)液覆蓋全部樣本區域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可通(tong)透細(xi)胞(bao)膜和核膜，從而使后(hou)續(xu)步驟(zou)的染色試(shi)劑充分進(jin)入細(xi)胞(bao)核進(jin)行反應，提高標記(ji)效率。孵(fu)育時間(jian)過長會增加組(zu)織(zhi)切片在后(hou)續(xu)洗滌步驟(zou)中(zhong)從載波片上脫落的風險，過短則(ze)可能(neng)造成(cheng)透性(xing)處理不(bu)充分，影響(xiang)標記(ji)效率。為得(de)到更好的結果，Proteinase K的濃度、孵(fu)育時間(jian)、溫度需根(gen)據不(bu)同(tong)類型組(zu)織(zhi)樣本進(jin)行優化。

（4）PBS漂(piao)洗切片2次(ci)，每次(ci)5 min，用濾紙吸去多(duo)余的液體(ti)，將(jiang)處(chu)理好的樣本放在濕(shi)盒中保持(chi)濕(shi)潤。

注：這一步(bu)必須(xu)把Proteinase K洗滌干凈(jing)，否則會(hui)嚴重干擾(rao)后續的標記反(fan)應(ying)。

（5）轉步驟2. TUNEL 反應。

冰凍(dong)組織(zhi)切片

（1）固(gu)定：取(qu)出(chu)冰凍切片(pian)，并(bing)回溫至室(shi)溫。加(jia)入適量4%多**醛（PBS配制(zhi)），室溫固定30 min。PBS漂洗2次，每次10 min。【注(zhu)】：若是擔(dan)心甲醛清洗不(bu)干凈，影響最終染色效果。可(ke)在甲醛固定完(wan)成后加(jia)入(ru)適量2 mg/mL 甘*酸(suan)清洗 10 min，中和殘留的固定液(ye)，再進行(xing)PBS清洗。

（2）用濾(lv)紙吸干(gan)切片樣(yang)本(ben)周(zhou)圍液體，用免疫(yi)組化筆圈(quan)好樣(yang)本(ben)輪廓，以便下游通透與標記。

注：若在后(hou)續實驗(yan)操作中(zhong)發(fa)現(xian)免疫組(zu)化筆畫的輪(lun)廓圈被(bei)破壞，需及時補畫。

（3）通透：按1: 100的比例(li)，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋(shi)至終濃(nong)度20 µg/mL，在每個樣(yang)本(ben)上滴(di)加100 µL，使溶液覆蓋全部樣(yang)本(ben)區域(yu)，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可通透細胞(bao)膜和核膜，從(cong)而使后(hou)續步驟(zou)的(de)染色試(shi)劑充(chong)分(fen)(fen)進(jin)入(ru)細胞(bao)核進(jin)行反應，提高標記(ji)效(xiao)率。孵育時間過(guo)長(chang)會增加組(zu)織切片在后(hou)續洗(xi)滌步驟(zou)中從(cong)載波(bo)片上脫落的(de)風險，過(guo)短則(ze)可能(neng)造成透性(xing)處理不充(chong)分(fen)(fen)，影響(xiang)標記(ji)效(xiao)率。為得(de)到更好的(de)結果，Proteinase K的(de)濃度、孵育時間、溫度需根據不同類型組(zu)織樣本(ben)進(jin)行優化。

（4）PBS漂(piao)洗切片2次，每次5 min，用濾紙吸去多(duo)余(yu)的液體，將處理好的樣本放在濕(shi)盒中(zhong)保(bao)持濕(shi)潤(run)。【注】：這一(yi)步(bu)必須把Proteinase K洗滌干(gan)凈，否則會嚴重干(gan)擾后續的標記反應。

（5）轉步驟(zou)2. TUNEL 反應。

陽性處(chu)理(li)（僅陽性對(dui)照(zhao)進行此步驟(zou)，其(qi)他樣品(pin)直接進行TUNEL反應步驟(zou)）

（1）按1: 10的比例用ddH2O將10× DNase I Buffer稀釋(shi)成1× DNase I Buffer備用。

（2）滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已(yi)處理的樣本(ben)(ben)上，覆(fu)蓋(gai)全部樣本(ben)(ben)區域，室溫平衡5 min。

（3）用1× DNase I Buffer以(yi)1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至(zhi)終濃(nong)度20 U/mL的工(gong)作液。

（4）棄去(qu)Buffer，加入100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液，室溫孵育10 min。

（5）棄去(qu)DNase I工作液，PBS清洗2次。

（6）轉步(bu)驟2. TUNEL 反應(ying)。

2. TUNEL 反應(ying)

配制(zhi)TUNEL反應液(ye)（即用(yong)即配）：

對于貼壁(bi)細胞(bao)、細胞(bao)涂片或組織切片

（1）每(mei)個樣本加入(ru)50 μL TUNEL反應(ying)液(ye)，使(shi)反應(ying)液(ye)均勻覆蓋樣本。37℃避(bi)光孵育適宜的時間(jian)（細胞推(tui)薦(jian)染(ran)色(se)時間(jian)30min-1h，組織染(ran)色(se)時間(jian)推(tui)薦(jian)2h）。【注】：50 μL TUNEL反(fan)應液適(shi)合(he)涂片(pian)(pian)、切片(pian)(pian)或96孔(kong)板（其他(ta)不同孔(kong)板可(ke)以(yi)適(shi)當調整TUNEL反(fan)應液體(ti)積，覆(fu)(fu)蓋細胞即可(ke)）。如果(guo)待檢測(ce)的樣(yang)(yang)品為涂片(pian)(pian)、切片(pian)(pian)或在24孔(kong)板、12孔(kong)板或6孔(kong)板中(zhong)，可(ke)以(yi)使(shi)用防(fang)蒸(zheng)發膜，或自行(xing)(xing)嘗試使(shi)用自封(feng)袋(dai)或者其它適(shi)當材料(liao)(liao)自行(xing)(xing)裁剪(jian)成(cheng)比孔(kong)略(lve)小的圓形塑(su)料(liao)(liao)片(pian)(pian)，滴加(jia)TUNEL反(fan)應液后覆(fu)(fu)蓋在樣(yang)(yang)品上，可(ke)以(yi)防(fang)止TUNEL反(fan)應液蒸(zheng)發，并(bing)且使(shi)TUNEL反(fan)應液均勻覆(fu)(fu)蓋樣(yang)(yang)本。

（2）棄(qi)去(qu)TUNEL 反應液，PBS漂洗2次，每次5 min。【注】：為了降(jiang)低背景，PBS漂洗(xi)切(qie)片1次后(hou)，可再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）漂洗(xi)3次，每(mei)次 5 min，這樣游離的未(wei)反應的標記物可以清除較干凈。

（3）（可選）每個樣本加入適量濃(nong)度為5 μg/mL 的DAPI染(ran)液，室溫(wen)避光孵(fu)育(yu)5 min。染(ran)色完成后(hou)，棄(qi)去DAPI染(ran)液，PBS漂洗(xi)2次(ci)，每次(ci)5 min。

（4）（可選）切片封片：將切片依次(ci)在純水、70%乙醇(chun)、80%乙醇(chun)、90%乙醇(chun)、95%乙醇(chun)、無水乙醇(chun)中(zhong)浸沒5 min，最后將切片樣(yang)(yang)本(ben)置于(yu)染(ran)色(se)缸中(zhong)以(yi)新鮮的(de)二甲苯浸泡，透明化處理2次，每次5 min。脫(tuo)水完成后，擦去切片周圍的(de)液(ye)體，每個樣(yang)(yang)本(ben)滴加50 μL抗熒光淬滅封(feng)片劑(ji)(ji)（抗熒光淬滅封(feng)片劑(ji)(ji)可能(neng)會(hui)不適用(yong)于(yu)某些染(ran)料，實驗(yan)前建議(yi)進行預實驗(yan)測試匹配性），蓋(gai)上蓋(gai)玻(bo)片，用(yong)鑷(nie)子的(de)鈍端輕(qing)輕(qing)敲擊(ji)蓋(gai)玻(bo)片，去除氣泡以(yi)使封(feng)片。

（5）用濾紙(zhi)吸去(qu)多余的液體，向(xiang)樣(yang)本區(qu)域加(jia)100 μL PBS保(bao)持(chi)樣(yang)本(ben)濕潤，立(li)即在(zai)熒(ying)光顯微鏡下觀察。

對于(yu)懸(xuan)(xuan)浮細胞(bao)或細胞(bao)懸(xuan)(xuan)液

（1）每個樣本(ben)管加入50 μL TUNEL反應液輕(qing)輕(qing)重懸細胞(bao)，37℃避光(guang)孵育30~60 min。每隔15 min用微(wei)量移液器輕(qing)輕(qing)重懸細胞(bao)。

（2）2000 rpm 離心5 min，棄去TUNEL 反應液，加入適量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中(zhong)含5 mg/mL BSA）輕(qing)輕(qing)重(zhong)懸細胞，并清洗2次。

（3）每個樣本管(guan)加入100 μL濃度為5 μg/mL的(de)DAPI染液，室溫避光孵育5 min。

（4）加入400 μL PBS重(zhong)懸細(xi)胞，立即用流式細(xi)胞儀檢測或進(jin)行涂片后在熒光(guang)顯(xian)微鏡下觀(guan)察。

注意(yi)事項

1. 本產品僅(jin)限(xian)于科學實(shi)驗研究使用，不得(de)用于臨床診(zhen)斷、治(zhi)療等領域。

2. 使用(yong)前請將(jiang)產品(pin)瞬時離心至管底，再進行后續實驗。

3. 染色背(bei)景較重或非特(te)異性著(zhu)色明顯(xian)時(shi)可(ke)適當減少染色時(shi)間。

4. 實驗時(shi)建議(yi)增(zeng)加(jia)陰性(xing)對照和陽性(xing)對照組。

5. 組(zu)分A使用(yong)時請(qing)佩戴(dai)口罩、手套，如接觸(chu)皮膚(fu)，請(qing)立即用(yong)大量水沖洗(xi)。

6. 熒(ying)光(guang)染料均存在淬(cui)滅問題，請(qing)盡量注意避光(guang)，以(yi)減(jian)緩熒(ying)光(guang)淬(cui)滅。

7. 為了您(nin)的安(an)全和健(jian)康(kang)，請穿實驗服并戴(dai)一次性手套操作(zuo)。

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