EZ 640 TUNEL細胞凋亡檢測試劑(ji)盒（遠紅熒光）

產品描述

細胞凋亡(wang)的一個顯(xian)著特(te)點是細胞染色體 DNA 的(de)(de)(de)降(jiang)解(jie)，這是一個較普遍的(de)(de)(de)現象。這種降(jiang)解(jie)非(fei)常特(te)(te)異并有規律，所產生的(de)(de)(de)不同長度的(de)(de)(de) DNA 片(pian)段約(yue)為 180 bp-200 bp 的(de)(de)(de)整(zheng)數倍，表現為瓊(qiong)脂糖(tang)(tang)凝膠電泳中(zhong)呈現特(te)(te)異的(de)(de)(de)梯狀 Ladder 圖譜，本(ben)試(shi)劑盒采用(yong)(yong) TUNEL 法，應(ying)用(yong)(yong)末(mo)(mo)端(duan)脫氧(yang)核糖(tang)(tang)核苷(gan)酸轉移酶(mei)(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在(zai)凋亡細(xi)胞(bao)(bao)(bao)斷裂(lie)DNA 的(de)(de)(de)3′-OH 末(mo)(mo)端(duan)催化(hua)摻入EZ 640-dUTP。 EZ 640-dUTP標記的(de)(de)(de) DNA 可(ke)以(yi)用(yong)(yong)熒光(guang)顯(xian)微鏡(jing)直接觀察或者用(yong)(yong)流(liu)式細(xi)胞(bao)(bao)(bao)儀(yi)定量。 TUNEL法可(ke)以(yi)選擇性的(de)(de)(de)檢測凋亡細(xi)胞(bao)(bao)(bao)， 而非(fei)壞死細(xi)胞(bao)(bao)(bao)或因輻照和藥(yao)物治療(liao)而造成(cheng)的(de)(de)(de) DNA 鏈斷裂(lie)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)。TUNEL 實驗中(zhong)， TdT 酶(mei)催化(hua) dUTP 摻入斷裂(lie)的(de)(de)(de) DNA 鏈的(de)(de)(de)3′-OH末(mo)(mo)端(duan)。抗原(yuan)標記的(de)(de)(de) dUTP（如digoxin-dUTP、生*素-dUTP），因(yin)為它可以(yi)直接進行原位(wei)檢(jian)測，是(shi)一(yi)種更快(kuai)速、直接的(de)檢(jian)測手(shou)段。

訂購信息

產品組分(fen)

運(yun)輸與保存(cun)

藍冰運輸(shu)。-20℃避光(guang)保(bao)存(cun)，有效期24個月。【注】：避免(mian)反復凍融。

實驗(yan)材料（自備）

PBS緩沖液（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配制）

0.1% Triton X-100（PBS配(pei)制，其中含(han)5 mg/mL BSA）

4%多(duo)**醛（PBS配制(zhi)）

免(mian)疫(yi)組化(hua)筆

脫(tuo)蠟溶劑(ji)（石蠟切片(pian)樣(yang)本）

石蠟(la)切片處理相關(guan)試劑(ji)

抗熒光淬滅封片劑

ddH₂O

使(shi)用方法(fa)

一、實驗(yan)設(she)計

1. 陽性對照（可(ke)選）：

　　DNase I處理制(zhi)備陽性對照載玻片。DNase I可以(yi)消化單(dan)鏈(lian)或(huo)(huo)雙鏈(lian)DNA產生單(dan)脫氧核苷(gan)(gan)酸或(huo)(huo)單(dan)鏈(lian)或(huo)(huo)雙鏈(lian)的(de)寡脫氧核苷(gan)(gan)酸的(de)核酸內切酶(mei)，人(ren)為造成細胞凋亡(wang)。

2. 陰性對照（可選）：

　　使用不(bu)含TdT Enzyme的(de)TUNEL Reaction Buffer，用(yong)ddH₂O替代TdT Enzyme。

3. 實(shi)驗處(chu)理(li)組。

4. 實(shi)驗對照組。

二(er)、實驗步驟

1. 樣本準備：

對于貼壁細(xi)胞或細(xi)胞涂片

（1）PBS清洗1次。【注】：如果(guo)擔(dan)心(xin)細胞(bao)涂片的細胞(bao)貼得不牢，可以(yi)干燥(zao)樣品使細胞(bao)貼得更牢。

（2）固定：加入適量4%多**醛（PBS配制(zhi)），室溫(wen)固(gu)定(ding)30 min。PBS清(qing)洗2次。

（3）通透(tou)：加(jia)入適(shi)量(liang)0.2% Triton X-100（PBS配制），室(shi)溫(wen)通透20 min。PBS清洗(xi)2次。

（4）轉步驟2. TUNEL 反應。

對于(yu)懸浮細胞或細胞懸液

（1）收集細胞（ 3-5×10⁶個細胞），1000 rpm離心(xin)5 min，PBS清(qing)洗2次。

（2）固定：加入適量(liang)4%多**醛（PBS配制）充分重懸(xuan)細胞，4℃固定30 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（3）通透(tou)：加入適量0.2% Triton X-100（PBS配制），室(shi)溫(wen)通透20 min。2000 rpm離(li)心5 min，PBS清洗2次。

（4）轉(zhuan)步驟(zou)2. TUNEL 反應。

石蠟組織切片(pian)

（1）脫蠟與水化(hua)：將(jiang)切片樣本依次放入二甲(jia)苯I（10 min）→ 二甲(jia)苯(ben)II（10 min）→ 100％乙(yi)(yi)醇(chun)I（5 min）→ 100％乙(yi)(yi)醇(chun)II（5 min）→ 95%乙(yi)(yi)醇(chun)（5 min）→ 90%乙(yi)(yi)醇(chun)（5 min）→ 80%乙(yi)(yi)醇(chun)（5 min）→ 70%乙(yi)(yi)醇(chun)（5 min）→ ddH2O沖洗5 min，沖洗2次。【注(zhu)】：二甲苯有毒(du)，易揮發，請在(zai)通風(feng)櫥中進行此操作。

（2）用(yong)濾紙吸干切片樣本(ben)周圍液體(ti)，用(yong)免疫組化筆圈好樣本(ben)輪廓(kuo)，以便下(xia)游通透與(yu)標記(ji)。

注：若在后續(xu)實(shi)驗操作中發現免疫組化筆(bi)畫(hua)的輪(lun)廓圈(quan)被破壞，需(xu)及(ji)時補畫(hua)。

（3）通透：按1: 100的比例(li)，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用(yong)PBS稀(xi)釋至終濃度20 µg/mL，在每個樣本(ben)上滴加(jia)100 µL，使溶液覆蓋全(quan)部樣本(ben)區(qu)域，20-37℃孵育(yu)20 min。【注】：Proteinase K可通透細胞膜和核(he)膜，從(cong)而使后(hou)續(xu)步(bu)(bu)驟的(de)染色試劑(ji)充分進入細胞核(he)進行(xing)反應，提高標(biao)(biao)記(ji)效率。孵(fu)育時間過(guo)長會增加組(zu)織切片(pian)在后(hou)續(xu)洗滌步(bu)(bu)驟中從(cong)載波片(pian)上脫落的(de)風險(xian)，過(guo)短則可能造成透性處理不充分，影響(xiang)標(biao)(biao)記(ji)效率。為得到更好的(de)結果(guo)，Proteinase K的(de)濃(nong)度(du)(du)、孵(fu)育時間、溫度(du)(du)需根據不同(tong)類型組(zu)織樣本進行(xing)優化。

（4）PBS漂洗切(qie)片2次，每(mei)次5 min，用濾紙(zhi)吸去多余的液體，將處(chu)理好的樣本(ben)放在(zai)濕盒中保持濕潤。

注：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xu)的標(biao)記反應。

（5）轉步驟2. TUNEL 反應。

冰凍組織(zhi)切片

（1）固(gu)定：取出(chu)冰凍切片，并回溫至室溫。加入適量4%多(duo)**醛(quan)（PBS配制），室溫(wen)固定30 min。PBS漂洗(xi)2次，每次10 min。【注】：若是擔心甲(jia)(jia)醛(quan)清洗(xi)不干凈，影響最(zui)終(zhong)染色效果。可在甲(jia)(jia)醛(quan)固定完成后加入適量2 mg/mL 甘*酸清洗(xi) 10 min，中和(he)殘(can)留(liu)的固定液，再進行(xing)PBS清洗。

（2）用濾紙吸干切片(pian)樣本周圍液(ye)體(ti)，用免疫組化筆(bi)圈(quan)好樣本輪廓(kuo)，以便下游通透(tou)與標(biao)記。

注：若(ruo)在后(hou)續實(shi)驗操作中(zhong)發現(xian)免疫組化(hua)筆畫(hua)的輪廓圈(quan)被破(po)壞，需及時補畫(hua)。

（3）通透：按(an)1: 100的比(bi)例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度20 µg/mL，在(zai)每個樣本(ben)上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本(ben)區域，20-37℃孵育20 min。【注(zhu)】：Proteinase K可通透細(xi)胞膜(mo)(mo)和核膜(mo)(mo)，從而使后(hou)續(xu)步驟(zou)的(de)染色試劑充分(fen)進入細(xi)胞核進行反(fan)應，提高標(biao)記效率。孵育時間(jian)過長(chang)會(hui)增加組(zu)(zu)織切片(pian)在后(hou)續(xu)洗滌步驟(zou)中(zhong)從載波片(pian)上脫(tuo)落(luo)的(de)風險，過短(duan)則可能造成(cheng)透性(xing)處理不充分(fen)，影響(xiang)標(biao)記效率。為得到更好(hao)的(de)結果，Proteinase K的(de)濃(nong)度(du)、孵育時間(jian)、溫度(du)需根據不同(tong)類(lei)型組(zu)(zu)織樣(yang)本進行優化。

（4）PBS漂洗切片(pian)2次，每(mei)次5 min，用濾紙吸去多余(yu)的液體，將處理(li)好(hao)的樣本放在濕(shi)盒中保(bao)持(chi)濕(shi)潤。【注】：這一步(bu)必須把Proteinase K洗滌干凈，否則(ze)會嚴重干擾后續的標記(ji)反應。

（5）轉步驟(zou)2. TUNEL 反應。

陽性(xing)處理（僅陽性(xing)對(dui)照進行此步驟，其(qi)他樣品(pin)直(zhi)接(jie)進行TUNEL反應步驟）

（1）按1: 10的比例用(yong)ddH2O將10× DNase I Buffer稀釋(shi)成1× DNase I Buffer備用(yong)。

（2）滴(di)加100 µL 1× DNase I Buffer到(dao)已(yi)處理的樣本上(shang)，覆蓋全部樣本區域(yu)，室溫平衡(heng)5 min。

（3）用1× DNase I Buffer以(yi)1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終(zhong)濃度20 U/mL的工(gong)作液。

（4）棄去(qu)Buffer，加入100 μL濃度為20 U/mL的(de) DNase I工作液，室溫孵育10 min。

（5）棄去(qu)DNase I工作液，PBS清洗2次。

（6）轉步驟2. TUNEL 反應(ying)。

2. TUNEL 反應

配制TUNEL反(fan)應液（即(ji)用即(ji)配）：

對于(yu)貼壁細胞(bao)、細胞(bao)涂(tu)片(pian)或組(zu)織切片(pian)

（1）每個樣本(ben)加(jia)入(ru)50 μL TUNEL反(fan)應液(ye)，使(shi)反(fan)應液(ye)均勻覆(fu)蓋(gai)樣(yang)本。37℃避光孵育適宜的時(shi)間(jian)（細胞推薦染色時(shi)間(jian)30min-1h，組織染色時(shi)間(jian)推薦2h）。【注】：50 μL TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液適(shi)(shi)合涂片、切(qie)片或(huo)(huo)96孔(kong)(kong)板（其(qi)他不同孔(kong)(kong)板可以適(shi)(shi)當調整TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液體積，覆(fu)蓋(gai)細胞即可）。如果待檢測的(de)樣品(pin)為(wei)涂片、切(qie)片或(huo)(huo)在24孔(kong)(kong)板、12孔(kong)(kong)板或(huo)(huo)6孔(kong)(kong)板中，可以使(shi)用防(fang)蒸(zheng)發膜(mo)，或(huo)(huo)自行嘗試使(shi)用自封袋或(huo)(huo)者其(qi)它適(shi)(shi)當材(cai)料自行裁剪(jian)成比孔(kong)(kong)略小的(de)圓形塑料片，滴(di)加TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液后覆(fu)蓋(gai)在樣品(pin)上(shang)，可以防(fang)止TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液蒸(zheng)發，并且使(shi)TUNEL反(fan)應(ying)(ying)液均勻覆(fu)蓋(gai)樣本。

（2）棄去TUNEL 反應(ying)液，PBS漂洗2次，每次5 min。【注】：為了降低(di)背(bei)景，PBS漂洗(xi)切片1次(ci)后，可再用0.1% Triton X-100（PBS配(pei)制，其中含5 mg/mL BSA）漂洗(xi)3次(ci)，每次(ci) 5 min，這樣游離的(de)未反應的(de)標記物可以(yi)清除較干凈(jing)。

（3）（可選(xuan)）每個樣本加(jia)入適量(liang)濃(nong)度為5 μg/mL 的DAPI染(ran)液(ye)，室(shi)溫避(bi)光(guang)孵育5 min。染(ran)色完成后，棄去DAPI染(ran)液(ye)，PBS漂洗(xi)2次，每次5 min。

（4）（可(ke)選(xuan)）切(qie)片封片：將切(qie)片依次在純水、70%乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)、80%乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)、90%乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)、95%乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)、無水乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)中(zhong)浸沒(mei)5 min，最后將(jiang)切(qie)片(pian)(pian)樣本(ben)置(zhi)于(yu)染色缸中(zhong)以新鮮的二(er)甲苯(ben)浸泡(pao)，透明(ming)化處(chu)理2次(ci)，每(mei)次(ci)5 min。脫(tuo)水完(wan)成后，擦(ca)去切(qie)片(pian)(pian)周圍(wei)的液體，每(mei)個樣本(ben)滴加(jia)50 μL抗熒光淬(cui)滅封片(pian)(pian)劑（抗熒光淬(cui)滅封片(pian)(pian)劑可能會(hui)不適用于(yu)某些(xie)染料，實驗前(qian)建議進行(xing)預實驗測試匹配性），蓋上蓋玻片(pian)(pian)，用鑷子(zi)的鈍(dun)端輕輕敲擊蓋玻片(pian)(pian)，去除氣泡(pao)以使封片(pian)(pian)。

（5）用濾(lv)紙(zhi)吸(xi)去多余(yu)的液體(ti)，向樣本區域加100 μL PBS保持樣本濕潤，立即在熒光顯微(wei)鏡下觀察。

對于懸浮細胞或細胞懸液

（1）每(mei)個樣(yang)本管加入50 μL TUNEL反應液輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)重懸(xuan)細(xi)胞(bao)，37℃避光孵育30~60 min。每隔15 min用微量移液器輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)重懸(xuan)細(xi)胞(bao)。

（2）2000 rpm 離心5 min，棄(qi)去(qu)TUNEL 反(fan)應液(ye)，加入適(shi)量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中(zhong)含(han)5 mg/mL BSA）輕輕重懸(xuan)細胞，并清洗2次。

（3）每個(ge)樣本(ben)管加入100 μL濃(nong)度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫(wen)避光孵育(yu)5 min。

（4）加入400 μL PBS重懸細胞，立即用流式(shi)細胞儀檢測(ce)或進行涂(tu)片后在熒光顯微鏡下(xia)觀察。

注意事(shi)項

1. 本產品僅限(xian)于科學實驗(yan)研究(jiu)使(shi)用，不得(de)用于臨床診(zhen)斷、治(zhi)療(liao)等領域(yu)。

2. 使用前請將(jiang)產品瞬時離(li)心至管底，再進行后續實驗(yan)。

3. 染色背景較重或非特異性著色明顯時可(ke)適當減少染色時間(jian)。

4. 實驗(yan)時建議增(zeng)加(jia)陰性對照(zhao)和陽性對照(zhao)組。

5. 組分A使(shi)用(yong)時(shi)請(qing)(qing)佩戴(dai)口(kou)罩、手(shou)套，如接觸皮膚，請(qing)(qing)立即用(yong)大量水沖洗。

6. 熒(ying)光(guang)(guang)染料均存在淬(cui)滅問題，請盡量注(zhu)意避光(guang)(guang)，以減緩熒(ying)光(guang)(guang)淬(cui)滅。

7. 為了您的(de)安全和健康，請穿實驗(yan)服并戴(dai)一次性手(shou)套操作。

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