EdU細胞增殖成像分析試劑盒

產品描述
細胞增殖是評價細胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指(zhi)標。EdU (5-Ethynyl-2`- deoxyuridine)是(shi)一種胸腺(xian)嘧啶核苷類似(si)物(wu)，其連有的(de)炔烴基(ji)團在(zai)天(tian)然(ran)化(hua)合物(wu)中很少(shao)見(jian)，能夠(gou)在(zai)細(xi)胞(bao)(bao)增殖(zhi)時期代替胸腺(xian)嘧啶(T)摻入正在(zai)復(fu)制的(de)DNA分子中，通過基(ji)于EdU與(yu)熒(ying)光染料的(de)特異性共(gong)軛(e)反應，把熒(ying)光基(ji)團標記(ji)到新合成的(de)含有EdU的(de)DNA上(shang)面，這樣可以(yi)進行高效快速的(de)檢(jian)測出DNA復(fu)制活性，此技(ji)術廣(guang)泛應用于細(xi)胞(bao)(bao)增殖(zhi)、細(xi)胞(bao)(bao)分化(hua)、生長與(yu)發育(yu)、DNA損(sun)傷修復(fu)等方面的(de)研究。
傳統的免疫熒光染色(se)(BrdU)檢(jian)測(ce)方法需要DNA變性(xing)、抗(kang)(kang)(kang)原修復(fu)、抗(kang)(kang)(kang)原抗(kang)(kang)(kang)體(ti)過夜孵育等復(fu)雜繁(fan)瑣的操(cao)作步驟。而(er)EdU檢(jian)測(ce)方法不需要劇烈的DNA變性(xing)，只(zhi)需溫(wen)和(he)的細胞(bao)固(gu)定化和(he)透化處(chu)理，能(neng)夠(gou)較(jiao)好地(di)保護細胞(bao)形(xing)態、DNA整(zheng)體(ti)結(jie)構(gou)(gou)及細胞(bao)內(nei)抗(kang)(kang)(kang)原識別位點，操(cao)作步驟更加快速、靈敏和(he)準確。EdU與胸腺嘧啶(T)結(jie)構(gou)(gou)非常相似，大(da)小(xiao)卻只(zhi)有BrdU抗(kang)(kang)(kang)體(ti)的1/500，很容易在(zai)(zai)細胞(bao)內(nei)擴散；無需抗(kang)(kang)(kang)原抗(kang)(kang)(kang)體(ti)反(fan)應，能(neng)在(zai)(zai)細胞(bao)和(he)組織(zhi)水平(ping)更快速便(bian)捷地(di)反(fan)映DNA復(fu)制活性(xing)。
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產品組(zu)分

運輸(shu)與保存
常溫運輸。4℃保存，有效期(qi)12個(ge)月。
使用(yong)方法（以24孔板，HK2貼壁細胞為例）
本試劑盒是采(cai)用(yong)(yong)成像檢測方(fang)法進行檢測，適用(yong)(yong)于熒光顯(xian)微鏡(jing)、共聚焦顯(xian)微鏡(jing)等儀器。以下方(fang)式適用(yong)(yong)于貼(tie)壁細(xi)胞(bao)；非貼(tie)壁細(xi)胞(bao)可在孵育(yu)EdU后(hou)進(jin)行細(xi)胞涂(tu)片處(chu)理(li)，固定后(hou)再(zai)采(cai)用(yong)貼壁細(xi)胞的染色(se)流程進(jin)行檢測。
EdU標記
1.將細胞培養(yang)基(ji)與EdU溶液(ye)按照(zhao)500：1的比例(li)混(hun)合(he)，制成2×EdU標記培養(yang)基(ji)。
2.提前將2×EdU標記培養(yang)基預熱，然后將150微升2×EdU標記培養(yang)基與等體積細(xi)胞培養(yang)基混合，獲得1×EdU溶(rong)液。
【注】：①不建議(yi)替換全部培養基(ji)，這樣可(ke)能(neng)會影響細胞增殖的速度。②配置好(hao)的培養基(ji)建議(yi)現用現配，用量(liang)以沒過細胞為宜(yi)。
3.孵育(yu)細胞2 h，棄培養基。
【注(zhu)】：①培養時間(jian)取(qu)決(jue)于細(xi)胞(bao)的增殖速度和生長狀態。②大多數腫瘤細(xi)胞(bao)以及粘(zhan)附(fu)細(xi)胞(bao)系均(jun)可采用(yong)2 h的孵育時間(jian)。
4.以1xPBS清(qing)洗(xi)細胞兩(liang)次(ci)，每次(ci)5 min, 以除去(qu)未(wei)摻(chan)入DNA的EdU殘留。
【注】：對于貼壁不牢的細胞可降(jiang)低清洗(xi)強(qiang)度(du)。
細胞(bao)的固定和通透(tou)
1.每孔加入(ru)150μL 4%多聚甲醛細胞固定液，室溫培養30 min，棄固定液。
2.每(mei)孔加入150μL 2mg/ml甘.an.suan，搖床孵育5 min，以(yi)中和過(guo)量的(de)多聚甲(jia)醛。
3.棄甘.an.suan.溶液(ye)，每孔(kong)加入300μL PBS 洗(xi)液(ye)，室溫清洗(xi)5 min。
4.每孔加入 300μL 0.5% Triton X-100 細胞通透液，室溫通透10 min，棄細胞通透溶液。
5.每孔加入300μL PBS洗(xi)液，室溫清洗(xi) 5 min。
EdU染色
1.通過(guo)用10：1去(qu)離子(zi)水稀釋反應緩沖液，進行配(pei)制(zhi)1×反應緩沖液。
2.按照(zhao)溶(rong)解(jie)200 mg緩沖添加(jia)(jia)劑(ji)溶(rong)于1 mL 去離子水的(de)比(bi)例稱取適(shi)量(liang)的(de)粉末進(jin)行溶(rong)解(jie)，即為(wei)可用的(de)緩沖添加(jia)(jia)劑(ji)的(de)濃(nong)度，建議(yi)現用現配。
【注】：緩沖添加劑為白色(se)粉末，較難準確(que)稱量(liang)，稱量(liang)范圍可稍(shao)微放(fang)寬，但是(shi)不應超(chao)過±20%，且該粉末較易氧化(hua)，使用后請旋緊管蓋，如試劑(ji)出現棕黃色(se)，則需報(bao)廢或更(geng)換(huan)。
3.按照以下的表格進行染(ran)色反應液的配制：

4.每(mei)孔加入100 μL配(pei)置好(hao)的檢測混(hun)合液，以覆蓋細(xi)胞為(wei)宜(yi)，避光、室(shi)溫(wen)孵育30 min。
5.棄染(ran)色反應液，加入300 μL 0.5% Triton X-100細胞(bao)滲透液(ye)清洗2-3次，每次10 min。
6.棄細胞滲透液，用PBS洗兩次(ci)，每次(ci) 5 min。
DNA染色
1.將Hoechst 33342 *超級純(chun)*（李記貨號(hao)：AC12L021）用PBS溶液1：1000進(jin)行稀(xi)釋(shi)得到1×Hoechst染(ran)色液。
2.每孔加入(ru)150 μL 1×Hoechst染色液(ye)，室溫避(bi)光(guang)孵育20-30 min后，棄(qi)染(ran)色液。
3.每孔加入300 μL PBS洗(xi)細胞兩次，去掉洗(xi)液(ye)。
圖像獲取及分析(xi)
　　建議(yi)染色完成后立即進(jin)行熒光顯微鏡(jing)拍照觀察；如(ru)果條件限制，請于4℃條件下避光濕潤保存3 d之內完成拍(pai)照。若為細胞爬片或(huo)涂片，可使用(yong)抗熒(ying)光淬滅封片劑(ji)進(jin)行封片后于4℃條件下保存及拍(pai)照檢測(ce)。

注意事項(xiang)

1. 本產品僅限于科學實驗研究使(shi)用(yong)(yong)，不得(de)用(yong)(yong)于臨床診斷、治療等領域(yu)。
   

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