Zeocin (博萊霉素)Zeocin即phleomycin D1，中文名稱博(bo)(bo)來霉素(su)或(huo)者(zhe)腐(fu)(fu)草霉素(su)D1，是從輪狀鏈(lian)霉菌(jun)(jun)(Streptomyces verticillus)的(de)一個突變體菌(jun)(jun)株中分(fen)離而來的(de)博(bo)(bo)來霉素(su)/腐(fu)(fu)草霉素(su)(bleomycin/phleomycin)的(de)抗(kang)生素(su)家(jia)族成員。它對細(xi)菌(jun)(jun)、真(zhen)菌(jun)(jun)(包括酵母)、植物和哺(bu)乳動物細(xi)胞均有抑制作用和細(xi)胞毒性。

Zeocin是一種堿(jian)性(xing)、水溶性(xing)的(de)(de)、銅離(li)子(zi)螯(ao)合(he)的(de)(de)糖肽抗(kang)生(sheng)素。Cu2+螯(ao)合(he)的(de)(de)Zeocin溶液呈現藍色，無活性(xing)。當其(qi)進入細(xi)(xi)胞后，Zeocin上的(de)(de)Cu2+被(bei)還原(yuan)為一價銅離(li)子(zi)(Cu+)，并被(bei)細(xi)(xi)胞內(nei)(nei)的(de)(de)巰基化合(he)物(sulfhydryl compound)清除，導(dao)致Zeocin被(bei)活化，能夠結合(he)到(dao)細(xi)(xi)胞內(nei)(nei)DNA上并使(shi)其(qi)斷裂(lie)，最終導(dao)致細(xi)(xi)胞死(si)亡。

對Zeocin產(chan)生抗性(xing)(xing)的(de)蛋白是來源(yuan)于(yu)(yu)印度鏈球菌(jun)(Streptoalloteichus hindustanus)的(de)Sh ble基因(yin)編碼一種14kDa大小的(de)蛋白，它能(neng)夠(gou)以(yi)一定比率結合(he)Zeocin，使(shi)其不能(neng)結合(he)細胞(bao)(bao)DNA，抑制其DNA斷(duan)裂活性(xing)(xing)，從而(er)使(shi)細胞(bao)(bao)對Zeocin產(chan)生抗性(xing)(xing)。因(yin)此，Zeocin可(ke)用來篩選表達(da)Zeocin抗性(xing)(xing)基因(yin)的(de)多克隆(long)(long)或單(dan)克隆(long)(long)細胞(bao)(bao)，或用于(yu)(yu)相應(ying)的(de)多克隆(long)(long)或單(dan)克隆(long)(long)細胞(bao)(bao)的(de)維持性(xing)(xing)培養。

Zeocin對于(yu)絕大多數好(hao)氧細(xi)(xi)胞均有效，常(chang)用(yong)(yong)于(yu)細(xi)(xi)菌(如大腸桿(gan)菌)、真核(he)微(wei)生(sheng)物(wu)(如酵母)及動(dong)植物(wu)細(xi)(xi)胞的(de)篩(shai)(shai)(shai)選(xuan)(xuan)。大腸桿(gan)菌篩(shai)(shai)(shai)選(xuan)(xuan)推(tui)薦(jian)濃度(du)為25~50μg/ml (低鹽(yan)LB培(pei)(pei)養基(ji)(ji)，NaCl濃度(du)不能(neng)超過(guo)5g/L)；酵母篩(shai)(shai)(shai)選(xuan)(xuan)推(tui)薦(jian)濃度(du)為50~300ug/ml (YPD或基(ji)(ji)本培(pei)(pei)養基(ji)(ji))；哺(bu)乳動(dong)物(wu)細(xi)(xi)胞篩(shai)(shai)(shai)選(xuan)(xuan)推(tui)薦(jian)濃度(du)為50~1000ug/ml (合適(shi)培(pei)(pei)養基(ji)(ji)，根據(ju)細(xi)(xi)胞系(xi)的(de)類型而不同)。實(shi)際(ji)應用(yong)(yong)時，應針(zhen)對不同的(de)細(xi)(xi)胞系(xi)測試(shi)Zeocin的(de)濃度(du)梯度(du)，以確定最佳使用(yong)(yong)濃度(du)。

訂購信息

藍冰運輸。-20℃避光保存，有效期12個月。【注】：避免反復凍融。

技術參數

1.CAS：11006-33-0

2.分子式：C55H85O21N20S2Cu

3.分子(zi)量：1474.03

4.溶(rong)解性：H2O: 50 mg/mL

5.結構式：

使用方法

1.細菌的篩選(以大腸桿菌為例)
（1）使用不含Tn5轉座子元件的宿主細胞DH5和DH10等進行篩選
（2）需使用低鹽LB培養基(10g胰蛋白胨，5g NaCl，5g酵母提取物，調整pH至7.5，加水定容至1L)以維持Zeocin的活性。
（3）Zeocin篩選的推薦濃度為25~50μg/ml。
2.真菌的篩選(以酵母為例)
（1）適用于釀酒酵母和畢赤酵母。
（2）培養基的選擇：含1M山梨醇的YPD培養基(適用于電穿孔法轉染細胞)；YPD或基本培養基(適用于化學法轉染細胞)。調整培養基pH至6.5~8.0，并選擇使用zui低有效濃度的Zeocin進行篩選。
（3）轉染方法：需使用電穿孔或鋰離子轉染法。不要使用酵母原生質球(spheroplasting)進行Zeocin抗性的轉染及篩選，因為Zeocin會導致原生質球的*死亡。
（4）Zeocin篩選的推薦濃度為50~300μg/ml。具體濃度與酵母菌株、培養基pH以及離子強度有關。
3.哺乳動物穩定表達細胞株的篩選
　Zeocin用于哺乳(ru)動物(wu)細(xi)胞(bao)(bao)篩(shai)(shai)選常(chang)用濃度(du)(du)為50-1000μg/ml (平(ping)均常(chang)用濃度(du)(du)為250-400μg/ml)。影響篩(shai)(shai)選濃度(du)(du)的(de)(de)主要(yao)因(yin)素包括離子強度(du)(du)、細(xi)胞(bao)(bao)類型(xing)、細(xi)胞(bao)(bao)生(sheng)(sheng)長(chang)密度(du)(du)以(yi)及生(sheng)(sheng)長(chang)速率。根(gen)據(ju)細(xi)胞(bao)(bao)類型(xing)的(de)(de)不同，需要(yao)1-2周可以(yi)篩(shai)(shai)選到Zeocin抗(kang)性(xing)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)。在篩(shai)(shai)選穩定(ding)表(biao)達細(xi)胞(bao)(bao)株之前，需要(yao)先(xian)確定(ding)能夠殺死(si)未轉(zhuan)染細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)Zeocin最(zui)佳(jia)工作(zuo)(zuo)濃度(du)(du)。Zeocin的(de)(de)最(zui)佳(jia)工作(zuo)(zuo)濃度(du)(du)需要(yao)通過劑量效(xiao)應曲線來確定(ding)。下表(biao)中列(lie)出(chu)了部分細(xi)胞(bao)(bao)中Zeocin的(de)(de)篩(shai)(shai)選濃度(du)(du)范圍以(yi)供參(can)考。

表1.部(bu)分常見(jian)哺乳動物細胞的Zeocin推薦(jian)篩選(xuan)濃度表

 （1）細胞(bao)對Zeocin敏感性的確定(ding)(殺滅曲(qu)線的建立)

①接種細胞使得細胞密度約為25%，按照8、16或24個細胞培養孔(分別為單個培養孔、復孔和三復孔)準備培養的細胞，培養24h。
②去除細胞培養液，換成含不同濃度Zeocin的新鮮篩選培養液(0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000μg/ml)。
③每2-4天更換新鮮的篩選培養液，觀察存活細胞的比例，選擇在1-2周內殺死所有細胞的zui低濃度作為最佳工作濃度。
（2）篩選Zeocin抗性的穩定細胞株
①按照20%-30%的細胞密度接種細胞，培養過夜。
②轉染攜帶Zeocin抗性基因的質粒或感染攜帶Zeocin抗性基因的病毒，同時設置沒有轉染質粒或感染病毒的細胞作為對照。說明：沒有轉染質粒或感染病毒的細胞，也需要同樣進行轉染質粒或感染病毒的相應實驗操作。
③轉染或感染48-72 h后，換成含有最佳工作濃度的Zeocin (由步驟a中的殺滅曲線確定)的新鮮培養液，繼續培養。如果有必要，可以對細胞進行傳代，略稀釋后進行篩選培養。
④每2-4天更換含有Zeocin的新鮮篩選培養液。
⑤對照組正常細胞100%死亡，Zeocin抗性組中存活的細胞即為表達Zeocin抗性基因的細胞。然后根據實驗目的進行多克隆或單克隆細胞的篩選。根據細胞種類和轉染/篩選效率，單克隆細胞株的形成可能需要一周或更多的時間。
【注】：若待篩選細胞對Zeocin的抗性明顯強于大部分細胞，則按照以下方法克服此類耐受性：用含Zeocin培養液進行細胞接種培養，置于37℃孵育2-3 h，使得細胞貼壁。然后將細胞置于4℃，2 h。需要使用HEPES作為培養基的緩沖體系。重新將細胞置于37℃孵育。4℃孵育細胞的目的是短時間內終止細胞分化，使得Zeocin能發揮作用，殺死細胞。
（3）穩定細胞株的維持培養
可采取如下幾種方式之一來維持培養穩定細胞株：
①使用含有與上述篩選穩定轉染細胞株相同濃度的Zeocin篩選培養液來維持培養。
②降低Zeocin濃度為篩選濃度的一半進行維持培養。
③使用剛好(hao)能(neng)預防敏(min)感細胞(bao)生長(chang)但不足(zu)以致死的Zeocin濃度(du)來(lai)維(wei)持(chi)培(pei)養(根據(ju)殺滅曲(qu)線來(lai)判(pan)斷)。

注意事項

1.本(ben)產品僅限(xian)于科學(xue)實驗研究(jiu)使用，不得用于臨床(chuang)診(zhen)斷、治療(liao)等(deng)領域(yu)。

2.用于細胞實驗，溶解后，須用一次(ci)性針(zhen)頭濾器過濾除(chu)菌(jun)。

3.Zeocin人體有害，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入(ru)體內。

4.Zeocin對光敏感，需(xu)避(bi)光保(bao)(bao)存于(yu)-20℃。含有該(gai)抗生素的平板或(huo)培養基也需(xu)避(bi)光保(bao)(bao)存。

5.高離子強度、酸或堿性(xing)都(dou)會抑制(zhi)Zeocin的活性(xing)，該抗生素(su)在過高或過低pH及弱氧化劑的條件下(xia)不(bu)(bu)穩(wen)定(ding)，且(qie)變性(xing)不(bu)(bu)可逆。在培(pei)養(yang)細菌時，需(xu)適當降低細菌培(pei)養(yang)基的鹽(yan)(yan)濃度(低鹽(yan)(yan)LB培(pei)養(yang)基，NaCl濃度不(bu)(bu)能超過5g/L)并調整pH至(zhi)7.5，從而使其(qi)保持活性(xing)。

6.為了您的安全和健康，請穿實(shi)驗服并戴(dai)一次(ci)性(xing)手套操作。

7.抗生素不穩定，請在有效期內盡快使用。
8.以上數據(ju)均(jun)來自(zi)公開(kai)文獻，李記生物(wu)暫未(wei)本(ben)產品進行獨立驗證，僅供(gong)參考。

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