EZ ECL Femto化學發光液（飛克級）

1. 取出(chu)印記膜，加入(ru)合適(shi)的封閉(bi)液在溫室下孵育20~60 min，同時振蕩，以封閉膜上(shang)非特異性(xing)蛋白結合位點。

2. 將膜從封閉液中取出(chu)，與一抗工作液在溫室孵育1 h，同時(shi)振蕩；或在28℃孵育過夜，不振(zhen)蕩。

3. 將足(zu)量(liang)的洗滌緩(huan)沖液加至(zhi)膜上(shang)，保證(zheng)緩(huan)沖液將膜*覆蓋。振蕩孵(fu)育≥5 min，更(geng)換(huan)洗滌緩沖液(ye)并(bing)重(zhong)復(fu)該步驟4~6次。增加洗(xi)滌緩沖液體積，洗(xi)滌次數和洗(xi)滌時間有助于降低背(bei)景信號。【注(zhu)】：①孵育前，膜在洗滌緩沖(chong)液中的短暫淋洗會提高洗滌效率。②按前文建議的(de)HRP標記二抗稀釋度非常重要的(de)。

4. 將HRP標(biao)記的二(er)抗(kang)工作(zuo)液與膜在溫室(shi)孵育(yu)1 h，同時振蕩。

5. 重復步(bu)驟3，以除去(qu)未結合(he)的HRP標(biao)記(ji)二抗。【注】：膜(mo)與HRP標記二抗(kang)孵育(yu)后必(bi)須進行(xing)*洗滌。

6. 將A溶液與B液等比例混合，制備(bei)成工作液。每cm²膜使用0.01~0.1 mL工(gong)作液，工(gong)作液可以(yi)在溫室(shi)下穩定8 h。
   【注】：暴(bao)露于日光(guang)(guang)或其(qi)他(ta)強(qiang)光(guang)(guang)下可能(neng)損害工(gong)作液，為獲得最佳結(jie)果(guo)，請(qing)將此工(gong)作液保(bao)存在(zai)琥珀色瓶中光(guang)；實驗室(shi)的常見照(zhao)明(ming)不會損(sun)害工(gong)作液。

7. 將印記膜在工作液中孵育5 min。從工作液中取(qu)出印記(ji)膜，并置于(yu)一個塑料(liao)片或清潔(jie)的塑料(liao)紙（膜）中，用一張吸水紙吸除(chu)多余(yu)的液體，并從印記(ji)和塑料(liao)紙之間小心地壓出氣泡。

8. 將包在塑料(liao)紙（膜）中的印記膜置于(yu)膠片(pian)(pian)暗盒(he)中，蛋白質面朝(chao)上，除適(shi)用于(yu)膠片(pian)(pian)曝光的燈（如紅色安全燈）之外，關閉所有的燈。
   【注】：①膠片必須在曝光期間保持干燥(zao)；②確保將(jiang)多余的底物從膜和塑料紙上*去(qu)除；③在(zai)整個膠(jiao)片處(chu)理(li)期間，使用手套。

9. 將X光(guang)膠片(pian)置于膜的上面。建議第一次曝光(guang)60 s。之后可調整曝光(guang)時(shi)間以達到最(zui)佳結果。化(hua)學發光(guang)反應在(zai)底(di)物(wu)孵育后的前5~30 min期間是強烈的。這一反應可以持續幾個小時，但強度會隨時間下降，如有底物孵育后較長時間后曝光，曝光時間可能需要延長以獲得較強信號。如果使用磷光存儲成像設備（如Bio-Rad的分子成像儀系(xi)統）或CCD照相機可能需要較長的曝光時(shi)間。
   【注】：膠片(pian)與(yu)膜之間的任何移動可能在膠片(pian)上造成人為的非特異信號。

10. 使用(yong)合適的(de)顯(xian)影(ying)劑和(he)定影(ying)劑對膠片進(jin)行顯(xian)影(ying)。如果信(xin)號太強(qiang)，則縮短曝光(guang)時間或將印(yin)記膜進(jin)行剝離(li)并降低(di)抗體(ti)濃度(du)重(zhong)新檢測。

1. 本產品僅限于科學(xue)實驗研(yan)究使用，不得(de)用于臨床診斷、治療等領(ling)域。

2. 為獲得最(zui)佳效果，必須優化該系統的全部(bu)組分，包括樣品量、一抗(kang)和二抗(kang)濃度(du)以及膜和封閉試劑的類型。

3. 使用本產品比使用(yong)沉淀比色HRP底物檢測所需(xu)的(de)抗體濃度低。為優化抗體濃度，請進行一次系統的(de)點印(yin)跡分(fen)析(xi)。

4. 沒有(you)一(yi)種(zhong)封(feng)(feng)(feng)閉(bi)試劑(ji)對所(suo)有(you)系(xi)統而言都(dou)是最佳的，所(suo)以為(wei)每(mei)一(yi)個免疫印跡(ji)檢(jian)(jian)測系(xi)統找到最合適(shi)的封(feng)(feng)(feng)閉(bi)緩(huan)沖液(ye)非常必需(xu)。封(feng)(feng)(feng)閉(bi)試劑(ji)有(you)可(ke)能(neng)與抗體(ti)產生交叉反應，導致出現(xian)非特異性(xing)信號。封(feng)(feng)(feng)閉(bi)緩(huan)沖液(ye)同時(shi)也會影響系(xi)統的靈敏(min)性(xing)。當從一(yi)種(zhong)底物轉換為(wei)另一(yi)種(zhong)底物時(shi)，有(you)時(shi)會出現(xian)信號衰減或背景增加(jia)的現(xian)象，原因可(ke)能(neng)是封(feng)(feng)(feng)閉(bi)緩(huan)沖液(ye)不適(shi)合新的檢(jian)(jian)測系(xi)統。

5. 使用親和素/生*素(su)檢測系統時，避免使(shi)用牛奶作為(wei)封閉試(shi)劑，因(yin)為(wei)牛奶中含有不定量的(de)內源性生*素(su)，會導致高背景信號(hao)。

6. 保證洗(xi)滌(di)緩(huan)沖液(ye)(ye)、封閉(bi)(bi)緩(huan)沖液(ye)(ye)、抗(kang)體(ti)溶液(ye)(ye)和底物工作液(ye)(ye)的(de)使用(yong)(yong)體(ti)積，以(yi)確保在整個實驗過程中(zhong)印跡(ji)膜(mo)*被液(ye)(ye)體(ti)覆蓋，避免膜(mo)變干。增大封閉(bi)(bi)緩(huan)沖液(ye)(ye)及洗(xi)滌(di)緩(huan)沖液(ye)(ye)的(de)使用(yong)(yong)量(liang)可以(yi)降低非(fei)特異(yi)性的(de)信號。

7. 為獲(huo)得(de)最佳效(xiao)果，在孵育步驟請(qing)使(shi)用搖床。

8. 將(jiang)Tween20(終(zhong)濃度0.05~0.1%)加(jia)入封閉緩沖液(ye)和稀(xi)釋的(de)抗體溶液(ye)，以降低(di)非特異信號。使用高品(pin)質(zhi)的(de)產品(pin)，如去(qu)污(wu)劑。它保(bao)存在安瓿中(zhong)，過氧化(hua)物和其他雜(za)質(zhi)含量很低(di)。

9. 不要(yao)使用疊氮鈉(na)作為(wei)緩沖(chong)液的防腐(fu)劑。疊氮鈉(na)是HRP的(de)抑制。

10. 避免手(shou)(shou)與膜(mo)直接接觸，實驗過程應戴(dai)手(shou)(shou)套或使用干凈的鑷子。

11. 所有設備必須清潔(jie)且不(bu)沾(zhan)染外來物質。金屬(shu)器械（如剪刀）不(bu)得具有可見的銹跡(ji)。銹跡(ji)可能(neng)導致斑點形成(cheng)和高(gao)背(bei)景(jing)。

12. 底(di)物工作液在室溫下可穩定8 h。日光(guang)(guang)或任(ren)何其他強(qiang)光(guang)(guang)下可(ke)能損害(hai)底物，為獲得最佳結果(guo)，將(jiang)底物工(gong)作液保存在琥珀色瓶中，并避(bi)免長(chang)期暴(bao)漏在任(ren)何強(qiang)光(guang)(guang)下，短時間暴(bao)漏于實(shi)驗室常規照明不會(hui)損害(hai)該工(gong)作液。