產品描述
　　Quick Cell PCR法支(zhi)原體檢測試劑盒(he)，本試劑盒采用一對(dui)(dui)支(zhi)原(yuan)體(ti)特異性引物，用于(yu)(yu)對(dui)(dui)樣(yang)品的支(zhi)原(yuan)體(ti)基(ji)因組(zu)DNA進行(xing)PCR擴增，然后(hou)通過瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠電泳對(dui)(dui)PCR產物進行(xing)檢(jian)測。試劑盒內同時含有內參對(dui)(dui)照，用于(yu)(yu)監控PCR是否正常擴增。

　　本試(shi)劑盒與MB Zell Shield 13-0050等產品相比(bi)更具優勢，替(ti)代(dai)性強，具體情況(kuang)可詳見下文(wen)或咨(zi)詢(xun)銷售人(ren)員。
　　本試劑盒是一種廣譜的支原(yuan)體檢測試劑盒，可(ke)以(yi)識別(bie)所有100多(duo)種至今(jin)已發現的(de)支原體(ti)；能(neng)用于檢測一切可(ke)能(neng)含支原體(ti)的(de)樣品(pin)，比如：體(ti)外細胞培養的(de)上(shang)清；血清；各(ge)種體(ti)液(ye)(ye)，如唾液(ye)(ye)、尿液(ye)(ye)、鼻(bi)腔分(fen)泌物等；其他液(ye)(ye)體(ti)樣品(pin)等。具有100%支原體(ti)識別率、靈敏(min)度*、含內參條帶(dai)從而可(ke)以區分(fen)真陰性樣品(pin)和(he)假陰性樣品(pin)、無需(xu)配套相對昂(ang)貴的(de)熒光定(ding)量PCR儀等優點。
　　經多(duo)次測試(shi)，本試(shi)劑盒有記(ji)錄可(ke)以(yi)識(shi)別在體(ti)外細(xi)(xi)胞培養中曾經報道出現的(de)20種支原(yuan)體(ti)，根據文(wen)獻報道，這些支原(yuan)體(ti)基本能占污染細(xi)(xi)胞的(de)支原(yuan)體(ti)種類的(de)100%。具體(ti)如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、（14）M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的(de)縮寫; A.為Acholeplasma的(de)縮寫）。

訂購信息

【注(zhu)】：
以(yi)下試劑需(xu)要自行準備：①普通(tong)的(de)Taq DNA 聚合(he)酶（推薦使用(yong) Takara 品牌的(de)Ex Taq Hot Start version，貨(huo)號：RR006A，已包(bao)含(han)2.5 mM 的(de) dNTP）和(he)相應的緩沖液(ye)；② 2.5 mM的dNTP；③DNA上樣緩沖液(ye)（推薦(jian)使(shi)用李記生物的(de)GelRed預染(ran)DNA上(shang)樣緩沖液(ye)(5X)，貨號：AN34L047，該緩沖液已含無毒核酸染(ran)料，不需要接觸 EB 等致(zhi)癌物(wu)質）。
運輸與(yu)保存條件
　　冰袋運(yun)輸，-20℃保(bao)(bao)存，可以保(bao)(bao)存五年。
使用方法
1.待測樣品的準備
取(qu)換(huan)液后培養(yang)2-3 d且匯合(he)度在90%左右的(de)細胞(bao)培養(yang)液上清(qing)（貼壁細胞(bao)）。懸浮(fu)培養(yang)的(de)細胞(bao)在換(huan)液傳代后，生(sheng)長2-3 d再取(qu)培養(yang)液進行(xing)檢測。可以按照以下(xia)兩種方法(fa)之(zhi)一進行(xing)樣品的(de)前處理(li)：
方(fang)法(fa)一
（1）取 150μL上述待(dai)測樣(yang)品(pin)到(dao)1.5 mL離心管內，在普(pu)通(tong)臺式離心機上1000 rpm 低速離心5 min；
（2）上述離(li)(li)心(xin)上清(qing)(qing)液，95 ℃加(jia)熱處理5 min（可以(yi)轉移到 PCR 管內，在(zai) PCR 儀上進行(xing)加(jia)熱處理），簡單離(li)(li)心(xin)（1000g，5 s）后，取上清(qing)(qing)進行(xing)檢測。
方(fang)法二（推(tui)薦本(ben)方(fang)法，有高速離心機的的可選用(yong)本(ben)方(fang)法，可以去PCR抑制物，準確性更高。）
（1）根(gen)據濃縮倍(bei)數(shu)，可以取100 - 1500μL上述(shu)待測樣品到1.5 mL離心(xin)(xin)管內，普通臺(tai)式離心(xin)(xin)機1000 rpm 離心(xin)(xin)5 min，將(jiang)離心(xin)(xin)后的上清(qing)轉移到(dao)另一個離心(xin)(xin)管內，丟棄細胞沉淀。
（2）將上清繼續(xu)13000 rpm（約16000 g）高速離心5 min，小心吸(xi)走(zou)全部上(shang)清(qing)，用(yong)50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5（推薦使(shi)用(yong)，樣品(pin)可(ke)以長(chang)期保存）或者去離(li)子水（樣品(pin)比較不穩定，只適(shi)合(he)當(dang)天或短期內(nei)檢測使(shi)用(yong)）重懸、沉淀（沉淀中含有(you)支原體(ti)），吹吸(xi)均勻(yun)。
（3）該重懸后(hou)的樣(yang)品可(ke)(ke)以(yi)直接(jie)檢測(ce)，也可(ke)(ke)以(yi)進行(xing)熱處(chu)(chu)理(li)后(hou)再檢測(ce)（熱處(chu)(chu)理(li)后(hou)，樣(yang)品保(bao)存更穩定）。熱處(chu)(chu)理(li)具體如下：95 ℃加(jia)熱處(chu)(chu)理(li) 5 min（可(ke)(ke)以(yi)轉移到PCR管(guan)內，在PCR儀上進行(xing)加(jia)熱處(chu)(chu)理(li)），簡單離(li)心（1000g，5 s）后(hou)，取上清進行(xing)檢測(ce)。
【注】：
① 這里的細胞培(pei)養上清不是(shi)指(zhi)細胞經(jing)*酶消化后的離心上清，而是(shi)指(zhi)至少培(pei)養 2 d后的(de)貼壁細(xi)(xi)胞培養(yang)液上清或懸浮細(xi)(xi)胞培養(yang)液；
② 本步驟的(de)低速離(li)心(xin)是為了去除哺乳動(dong)物細胞，以(yi)排除其不必(bi)要的(de)干擾。所以(yi)離(li)心(xin)力(li)要嚴格控制在150-200 g，該(gai)離(li)心(xin)力(li)下，哺乳動(dong)物細胞將被沉淀下來而(er)支原體不會；
③ 收集的待測細(xi)胞培養(yang)液樣品如果(guo)不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存；
④ 如(ru)果預期(qi)待測樣(yang)品支原體含量較少（比如(ru)低溫保(bao)存的血清(qing)、臍帶血、*mei、抗生素(su)、未使用的培(pei)養液、生物制(zhi)品、極個別(bie)細胞培(pei)養上清(qing)等），可以(yi)采(cai)取措施以(yi)提高檢測的靈敏(min)度，具體方法請看后(hou)文注意事項部分(fen)：如(ru)何提高本試(shi)劑盒檢測靈敏(min)度。
2.PCR 體系(xi)的配制  
（1）按(an)照25μL體(ti)(ti)系配制(zhi)比例如下。如果是多(duo)樣(yang)品檢測，加兩個對(dui)照樣(yang)品后各組分(fen)總體(ti)(ti)積(ji)如下表(biao)。配制(zhi)好的混(hun)合液，按(an)每(mei)管23μL分(fen)裝到(dao)0.2 mL的(de)PCR管(guan)中。

【注】：
① 總體積(ji)中(zhong)多配制(zhi) 6% 是為了防止移液導(dao)致誤差，以保證每個(ge)反(fan)應管(guan)中(zhong)的反(fan)應液足量；
② 如果有條件，PCR 體系的配制建議在冰上進行操作；
③ 本(ben)試劑(ji)盒不推薦(jian)使(shi)用 2× 的 PCR mixture（內含 Taq 酶、緩沖液(ye)和 dNTP），建議使(shi)用Taq酶、10×Taq 緩沖液(ye)和 dNTP 等(deng)試劑(ji)配制PCR體系；
④ 為了避(bi)免可(ke)(ke)能的污(wu)染(ran)，收到的支(zhi)原體引(yin)物和內參，可(ke)(ke)以適當分裝（比如：每支(zhi) 40μL）后(hou)冷凍保(bao)存；
⑤ 如(ru)果使用的(de)是其他 Taq 酶(mei)（前(qian)提是：陰性對照的(de) 586 bp 內(nei)參(can)條帶(dai)必須有一定(ding)(ding)亮(liang)度，且穩定(ding)(ding)性良好，否則不能使用），酶(mei)、去離(li)子水(shui)的(de)加(jia)入量需(xu)要(yao)根據其說明書進行調(diao)整。
（2）加入(ru)待測(ce)樣(yang)品(pin)、陰性和陽性對照樣(yang)品(pin)。樣(yang)品(pin)檢測(ce)管(guan)中加入(ru)2μL待測(ce)樣(yang)品(pin)，陰性對照管(guan)加入(ru)2μL去離子水，陽性對照管(guan)加入(ru)2μL陽性支原體 DNA。
【注】：
① 裝(zhuang)有陽(yang)性(xing)支原體(ti) DNA 的螺口管開蓋(gai)之(zhi)前，低速離心或用手指捏住，用力甩(shuai)一下即(ji)可(ke)；
② 進行反應體(ti)系配制的房間，與(yu)樣品(pin)前處理(li)、加陽性對照DNA、樣品(pin)DNA的房間建議分開。
3.PCR 參數設置

4.PCR 產(chan)物的瓊脂糖凝(ning)膠電泳(yong)
　　配(pei)制含溴化乙(yi)錠（EB）的濃度為 1.5%的 DNA 瓊脂糖凝膠（推薦使(shi)用(yong)李記生(sheng)物的GelRed預(yu)染DNA上樣(yang)緩沖(chong)液(5X)，貨(huo)號：AN34L047，該產品預添加了無(wu)毒(du)安全染料(liao)）；當溴(xiu)酚(fen)藍染(ran)料跑出上樣孔 3-4 cm時(shi)，停止電泳(yong)，拍照。
5.結(jie)果判斷(duan)  
PCR 擴增的結果有可能(neng)出(chu)現以下(xia)幾種情(qing)況(kuang)：

　　支(zhi)(zhi)原體(ti)(ti)(ti)(ti) PCR 擴增結果(guo)：586 bp 條帶為(wei)內參條帶，270 bp 左右的條帶為(wei)支(zhi)(zhi)原體(ti)(ti)(ti)(ti)特異條帶（各支(zhi)(zhi)原體(ti)(ti)(ti)(ti)的條帶大(da)小會(hui)略有不同，總體(ti)(ti)(ti)(ti)在 266-280 bp 之間。注意：支(zhi)(zhi)原體(ti)(ti)(ti)(ti)特異條帶的大(da)小不會(hui)超過(guo)該范圍。超過(guo)該范圍的，就是雜帶！）。隨著支(zhi)(zhi)原體(ti)(ti)(ti)(ti) DNA 模板(ban)的增加，270 bp 左右的條帶會(hui)逐(zhu)漸增強而 586 bp 的內參條帶會(hui)逐(zhu)漸減弱(ruo)，甚至消失。
　　泳道1：陰(yin)性對(dui)照或者沒(mei)有支原體污(wu)染的樣品；
　　泳道2：極重(zhong)度支原體污(wu)染樣品；
　　泳道3：重度污染樣品；
　　泳道4：中(zhong)度污染樣品(pin)；
　　泳道(dao)5：輕度(du)污染樣品(pin)；
　　泳道6：PCR 的(de)擴增(zeng)被細胞的(de)代謝產物抑制，導致擴增(zeng)失敗。
　　M：DNA marker.
注意事項
1.設(she)有(you)陰性對照，保(bao)證本試劑盒含有(you)的支(zhi)原體引物和內(nei)參以及整個反應體系正常。
2.只有當陰性對照的(de)結果沒(mei)有出現 270 bp 左右的(de)支原體特異條帶(dai)時(shi)，其他樣品的(de)檢測結果才是可信的(de)。
3.每次(ci)試(shi)(shi)驗陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)中 586 bp 的(de)(de)(de)內(nei)參條帶(dai)都必須出(chu)(chu)現(xian)而且要(yao)有一定的(de)(de)(de)亮(liang)度(du)，才(cai)說明試(shi)(shi)驗成功。如果陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)的(de)(de)(de)內(nei)參條帶(dai)經常沒有出(chu)(chu)現(xian)或者非(fei)常弱，說明試(shi)(shi)驗不成功，這時可(ke)以(yi)(yi)采取(qu)以(yi)(yi)下幾(ji)個(ge)措(cuo)施： a.請(qing)使(shi)用普(pu)通蒸餾水或去(qu)(qu)離(li)子水。不能(neng)使(shi)用去(qu)(qu)內(nei)毒(du)素的(de)(de)(de)水、DEPC 處理的(de)(de)(de)水或者商品化的(de)(de)(de) DNase/RNase-free的(de)(de)(de)水，這幾(ji)種水都可(ke)能(neng)會抑制 PCR 擴增(zeng)的(de)(de)(de)效率(lv)。 b.請(qing)使(shi)用 Takara 公司的(de)(de)(de) Ex Taq Hot Start version（推薦。貨號： RR006A，可(ke)用 400 次(ci)）。 c.可(ke)以(yi)(yi)嘗試(shi)(shi)增(zeng)加 PCR 的(de)(de)(de)循(xun)環數，比如：由(you)原來的(de)(de)(de) 40 個(ge)循(xun)環，增(zeng)加到(dao) 45 個(ge)循(xun)環。如果采取(qu)以(yi)(yi)上(shang)幾(ji)個(ge)措(cuo)施后，陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)的(de)(de)(de)內(nei)參條帶(dai)仍(reng)然經常沒有出(chu)(chu)現(xian)或者非(fei)常弱，請(qing)聯(lian)系廠家解決(jue)。
4.如(ru)(ru)果(guo)直接(jie)使用細胞培養液(ye)上(shang)清進(jin)行檢測(ce)，而檢測(ce)結果(guo)顯示(shi)該樣(yang)(yang)品(pin) 586 bp 條(tiao)帶和 270 bp 左(zuo)右的(de)條(tiao)帶都(dou)沒有出現（如(ru)(ru)圖 1，泳道 6）或者內參條(tiao)帶非常微弱，在(zai)排(pai)除 PCR試劑的(de)問題后,說明該樣(yang)(yang)品(pin)含有抑制 PCR 擴增的(de)代謝產物。
5.防(fang) DNA 污染注意事(shi)項： a.強烈建議(yi)所有(you)操作(zuo)全部使(shi)用進(jin)口濾(lv)(lv)芯吸(xi)頭（比如：Axygen 濾(lv)(lv)芯吸(xi)頭）進(jin)行操作(zuo)，以免試劑被污染。 b.“PCR 體(ti)系配(pei)制的房(fang)(fang)間(jian)(jian)、移(yi)液(ye)槍(qiang)(qiang)"（不(bu)要使(shi)用細胞培養(yang)室的移(yi)液(ye)槍(qiang)(qiang)！）和(he)“PCR 產(chan)物的電泳房(fang)(fang)間(jian)(jian)、移(yi)液(ye)槍(qiang)(qiang)"一定要分(fen)(fen)開(kai)，不(bu)能在(zai)同一個房(fang)(fang)間(jian)(jian)進(jin)行，也不(bu)能使(shi)用相同的移(yi)液(ye)槍(qiang)(qiang)進(jin)行操作(zuo)。 c.PCR 產(chan)物是導(dao)致假陽(yang)性的主要原(yuan)因(yin)，PCR 產(chan)物不(bu)要在(zai) PCR 體(ti)系配(pei)制的房(fang)(fang)間(jian)(jian)中打開(kai)。 d.樣品處理(li)的房(fang)(fang)間(jian)(jian)和(he)移(yi)液(ye)槍(qiang)(qiang)，如有(you)條件(jian)，建議(yi)也分(fen)(fen)開(kai)。 e.收到(dao)的支原(yuan)體(ti)引物和(he)內(nei)參，可以分(fen)(fen)裝（比如 40 μL一支）后保(bao)存。
6.如發現細胞被支原體污染，推薦(jian)使用李記生物的Quick Cell支原(yuan)體(ti)祛除預防(fang)試劑(ji)盒，貨號(hao)：AC16L066；以及EZ 水浴鍋抑菌劑(ji)，貨號：AC16L162 和(he) EZ 細(xi)胞房除(chu)菌(jun)劑，貨號(hao)：AC16L143。產品(pin)詳情(qing)可咨詢銷售人員(yuan)或見(jian)李記生物(wu)網站。
7.支(zhi)原體(ti)檢測(ce)樣品可以分成兩(liang)類：①用含血清(qing)的培(pei)養液培(pei)養的哺乳動物細(xi)胞上清(qing)液，由于(yu)該(gai)條件非常適合支(zhi)原體(ti)生長(chang)，培(pei)養數天后，支(zhi)原體(ti)密度一般較高(gao)，可達 10^7-9/mL，可以直接檢(jian)測。②低溫保存的血(xue)漿、血(xue)清、臍帶血(xue)、*酶、抗生素、未(wei)使用(yong)的培養液等樣(yang)品(pin)，由于(yu)這些(xie)(xie)樣(yang)品(pin)即(ji)使有支(zhi)原體(ti)污(wu)染，支(zhi)原體(ti)含(han)量一般很少，直接使用(yong)快(kuai)速支(zhi)原體(ti)檢(jian)測試劑盒(he)進行檢(jian)測，往(wang)往(wang)檢(jian)測不出來。這些(xie)(xie)樣(yang)品(pin)建議(yi)：（1）對樣品(pin)的支原(yuan)體進行離心濃縮處(chu)理；（2）使(shi)用支原體液體培養(yang)基（必須同時接種(zhong)不(bu)含jing氨(an)酸(suan)和含jing氨(an)酸(suan)的兩種(zhong)支原體液體培養(yang)基）培養(yang) 3-7 d后(hou)，再進行(xing)檢(jian)測。具體方法請參考(kao)李記生物(wu) Quick Cell 發光法支原體檢測(ce)試劑盒，貨(huo)號：AC16L062 說明書(shu)中后的注意(yi)事項部分。該方法速度較(jiao)慢，需要 3-7 d，但是可靠性高。
8.該產品主要(yao)用于細胞(bao)上清支原(yuan)體污染檢測，僅限(xian)于(yu)科學(xue)實驗研究使用，不(bu)得用于(yu)臨床診(zhen)斷、治療等(deng)領域。
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