Quick Cell 發光(guang)法支(zhi)原體檢測試(shi)劑(ji)盒

產品(pin)描(miao)述(shu)
　　Quick Cell發光法支原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)檢(jian)(jian)測(ce)試(shi)劑盒，通過檢(jian)(jian)測(ce)支原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)的特異性酶活性以(yi)達到檢(jian)(jian)測(ce)體(ti)(ti)外培養(yang)的哺乳動物細胞是否被(bei)支原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)污染(ran)的目的。
　　在(zai)(zai)支(zhi)原(yuan)體裂解后，該(gai)支(zhi)原(yuan)體特(te)異性(xing)的(de)(de)(de)(de)酶(mei)(mei)，在(zai)(zai)底物(wu)存在(zai)(zai)下(xia)，具(ju)有(you)(you)將ADP轉(zhuan)化(hua)(hua)成ATP的(de)(de)(de)(de)功能(neng)。由于(yu)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)酶(mei)(mei)（Luciferase）催化(hua)(hua)底物(wu)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)（Luciferin）產生光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)反應(ying)需要ATP的(de)(de)(de)(de)參與，支(zhi)原(yuan)體特(te)異性(xing)酶(mei)(mei)催化(hua)(hua)產生的(de)(de)(de)(de)ATP含量(liang)(liang)，可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)該(gai)反應(ying)轉(zhuan)化(hua)(hua)成生物(wu)發光(guang)(guang)(guang)（Bioluminescence）信號(hao)，該(gai)信號(hao)可(ke)以(yi)使用專門的(de)(de)(de)(de)發光(guang)(guang)(guang)檢測(ce)(ce)儀(yi)（Luminometer）或具(ju)有(you)(you)發光(guang)(guang)(guang)檢測(ce)(ce)功能(neng)的(de)(de)(de)(de)多功能(neng)酶(mei)(mei)標儀(yi)進行檢測(ce)(ce)，發光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)強(qiang)度與ATP的(de)(de)(de)(de)含量(liang)(liang)成正比。通(tong)過(guo)比較細(xi)(xi)胞培(pei)養(yang)上(shang)清(qing)(qing)和未用于(yu)細(xi)(xi)胞培(pei)養(yang)的(de)(de)(de)(de)培(pei)養(yang)液(ye)上(shang)清(qing)(qing)二(er)者(zhe)的(de)(de)(de)(de)支(zhi)原(yuan)體特(te)異性(xing)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)含量(liang)(liang)，即可(ke)知(zhi)道培(pei)養(yang)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞是否被支(zhi)原(yuan)體污染。反應(ying)原(yuan)理如(ru)下(xia)：

訂購(gou)信息

運輸(shu)與保存
干冰運輸。-20℃短(duan)期保存，-80℃長(chang)期保(bao)存；有效期60個月。
使用方(fang)法
1.檢測試劑的準(zhun)備
　　產品從(cong)-80 ℃冰箱(xiang)取出，在冰上操(cao)作，*使用(yong)(yong)，分別用(yong)(yong)2.5 mL支原體檢(jian)測溶(rong)液溶(rong)解(jie)(jie)試劑(ji)A和(he)試劑(ji)B（注：因為試劑(ji) A 和(he)試劑(ji) B 的(de)離(li)心管(guan)(guan)容量(liang)不足2.5 mL，可(ke)以分別先用(yong)(yong)1 mL 支原體檢(jian)測溶(rong)液將(jiang)凍干的(de)試劑(ji) A 和(he)試劑(ji) B 溶(rong)解(jie)(jie)后，轉(zhuan)移到(dao)一個(ge)(ge)5 mL 或(huo)10 mL 的(de)離(li)心管(guan)(guan)中(zhong)，再各補加1.5 mL 支原體檢(jian)測溶(rong)液）。按每(mei)管(guan)(guan)50 μL可(ke)分別分裝到(dao)50個(ge)(ge)1.5 mL離(li)心管(guan)(guan)中(zhong)，根據待(dai)(dai)檢(jian)測的(de)樣品數(shu)量(liang)及陰性對照數(shu)量(liang)確定A、B試劑(ji)的(de)用(yong)(yong)量(liang)（不用(yong)(yong)的(de)試劑(ji)放(fang)(fang)置于-80 ℃冰(bing)箱低(di)溫保存，隨用(yong)(yong)隨取）。試劑(ji)A和(he)試劑(ji)B，放(fang)(fang)室溫5 min左右（注：不能加熱(re)），等(deng)其熔解(jie)(jie)后放(fang)(fang)冰(bing)上(shang)待(dai)(dai)用(yong)(yong)。
【注】：試(shi)劑(ji) A 和試(shi)劑(ji) B 只能(neng)在(zai)每次檢測(ce)之前從-80 ℃冰箱取出(chu)的(de)，熔解后(hou)在(zai)室(shi)溫(wen)放置的(de)時間盡可能(neng)的(de)短，不(bu)能(neng)超(chao)過(guo)20 min。熔解后(hou)，放冰上的(de)時間也不(bu)能(neng)超(chao)2 h。已經融(rong)化后(hou)的(de)試(shi)劑(ji) A 和試(shi)劑(ji) B 不(bu)能(neng)再次凍(dong)存使用(yong)。
2.陰性對照的設置(zhi)
　　本試劑盒(he)每次檢測(ce)都(dou)必(bi)須設置陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)。陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)除(chu)了沒有培(pei)(pei)養細(xi)胞外其(qi)他(ta)成分*相同，包括其(qi)中的(de)血清批次、含量、抗(kang)生素(su)等含量也必(bi)須*相同。陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)配制完后放于4℃冰箱。如果有些樣(yang)品實在沒有合適的(de)陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)或者不知道樣(yang)品原(yuan)來的(de)培(pei)(pei)養基(ji)組成，可以嘗試使用含10%血清的(de) DMEM 培(pei)(pei)養基(ji)作為陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)。
3.陽性(xing)對照的設置
　　可用已經(jing)檢(jian)測含有支(zhi)原體污染的樣品作為陽性對照。
4.待測樣品的準備
　　為了準確判斷(duan)細胞(bao)是否有支原體(ti)的污染，具體(ti)操作(zuo)如下（請嚴格按(an)照相應的體(ti)積(ji)進行(xing)操作(zuo)）：
（1）貼壁細(xi)胞待測的(de)(de)細(xi)胞培養(yang)3 d且匯合(he)度在70-90%左右時，取(qu)(qu)180μL-1500μL培養(yang)液(ye)上清，在普通(tong)臺式離(li)(li)心機上150 g (大約1000 rpm )低速離(li)(li)心 5 min，準確吸(xi)取(qu)(qu)離(li)(li)心后的(de)(de)上清到(dao)一(yi)個新的(de)(de)1.5 mL離(li)(li)心管(guan)(guan)內，丟棄含(han)細(xi)胞沉淀的(de)(de)原(yuan)有(you)離(li)(li)心管(guan)(guan)。懸浮培養(yang)的(de)(de)細(xi)胞需要在換液(ye)傳代后，至少讓細(xi)胞生長3 d再取(qu)(qu)培養(yang)液(ye)進行上述操作。
【注1】：離(li)(li)心(xin)力(li)(li)要嚴(yan)格控制在150 g左右，該離(li)(li)心(xin)力(li)(li)下(xia)，哺乳動物細(xi)(xi)胞將(jiang)被沉(chen)淀(dian)下(xia)來(lai)而(er)(er)支原(yuan)體(ti)不(bu)會。更高(gao)的(de)離(li)(li)心(xin)力(li)(li)將(jiang)可能導致(zhi)支原(yuan)體(ti)也被離(li)(li)心(xin)下(xia)來(lai)，從(cong)而(er)(er)導致(zhi)假(jia)(jia)陰(yin)性(xing)。而(er)(er)更低的(de)離(li)(li)心(xin)力(li)(li)將(jiang)可能導致(zhi)哺乳動物細(xi)(xi)胞不(bu)能被離(li)(li)心(xin)沉(chen)淀(dian)下(xia)來(lai)，從(cong)而(er)(er)導致(zhi)支原(yuan)體(ti)經測時，哺乳動物細(xi)(xi)胞內(nei)的(de)ATP也被釋放到溶液中，從(cong)而(er)(er)導致(zhi)假(jia)(jia)陽性(xing)。
【注2】：待測細胞上(shang)清樣品越多，越有利于支原體(ti)(ti)污染濃縮富集，1500μL培(pei)養液上(shang)清，經后(hou)續處(chu)理后(hou)，支原體(ti)(ti)濃度(du)提高10倍(bei)左右。
【注3】：制備(bei)好的待測(ce)樣(yang)品(pin)如果不(bu)是(shi)當天立即檢(jian)測(ce)，放于-80℃冰箱保(bao)存，不(bu)得放于室溫(wen)、4 ℃或-20 ℃冰箱，樣(yang)品(pin)在-80℃可(ke)以(yi)保(bao)存1 年(nian)；為了日(ri)后檢(jian)測(ce)方(fang)便(bian)，應(ying)該同時凍存一些作(zuo)為陰性對照的培養液。
（2）將(jiang)含有(you)上(shang)清的1.5 mL離心管，在(zai)臺式離心機上(shang)16000 g（大(da)約13000 rpm）高(gao)速離心5 min，棄去上(shang)清。
【注】：切勿讓吸頭碰到(dao)離心管底部，底部為(wei)可能含有支原(yuan)體的沉(chen)淀。往離心管內，加入120 μ*期配好的陰性對(dui)照(zhao)培養(yang)液(ye)。
（3）將上(shang)述經過離心(xin)清洗一次的(de)樣(yang)品，再(zai)次在(zai)普通臺式離心(xin)機上(shang)16000 g（大約(yue) 13000 rpm）高速離心(xin) 5 min，同樣(yang)小心(xin)吸走離心(xin)后(hou)的(de)上(shang)清并丟棄。
【注】：同(tong)樣勿讓吸(xi)頭(tou)碰(peng)到(dao)離心管內壁的(de)底部外側。留下(xia)大約(yue)5 μL培養(yang)液的(de)目的(de)也是為了防止吸(xi)頭(tou)碰(peng)到(dao)離心管底部外側而將可能含(han)有支原體(ti)的(de)沉淀(dian)吸(xi)走；注意離心管放置方向與(yu)上一次離心時相(xiang)同(tong)。
（4）向上述經(jing)過兩次離心清(qing)洗的樣(yang)品中加入115 μL陰性對照的培養液，用移(yi)液槍(qiang)上下吹吸10-20 次，將可能含有支(zhi)原(yuan)體(ti)的沉淀吹打均勻，用于后續支(zhi)原(yuan)體(ti)檢測（夠兩次檢測使用）。此時(shi)，總體(ti)積仍然(ran)約為120 μL）。
【注】：將培養(yang)液替(ti)換成陰性對照的培養(yang)液是為了排除一(yi)些細胞代謝產物對后續檢(jian)測的可(ke)能干(gan)擾。
5.支原體樣(yang)品檢測
（1）將溶解(jie)后的試(shi)劑(ji) A、試(shi)劑(ji) B放冰上(shang)融(rong)化(hua)（注意：不能加熱），試(shi)劑(ji)A和(he)試(shi)劑(ji)B融(rong)化(hua)后立(li)即用(yong)于(yu)檢測(ce)。試(shi)劑(ji)A、試(shi)劑(ji)B融(rong)化(hua)1 h后，檢測(ce)靈敏度開始顯著降低，試(shi)劑(ji) A和(he)試(shi)劑(ji) B融(rong)化(hua)后不能反復凍融(rong)使用(yong)。
（2）吸取(qu)50 μL陰性(xing)對照(zhao)、陽性(xing)對照(zhao)和待測樣品，分別移入(ru)不透明（白色(se)或者(zhe)黑色(se)均可）的(de)96孔板內，加入(ru)50 μL冰(bing)上放置的(de)試劑 A，室溫反應 15 min。
【注(zhu)】：不(bu)能使用(yong)透(tou)明(ming)的 96 孔板，否則孔與孔之間的發光值會互相干擾。
（3）吸(xi)取50 μL冰上放(fang)置的(de)試劑B，加入到已(yi)反(fan)應15 min的(de)上述(shu)反(fan)應液(ye)中，立(li)即在(zai)多功能(neng)酶標(biao)儀(yi)或者(zhe)發(fa)(fa)光(guang)檢(jian)(jian)測儀(yi)（Luminometer）上，以儀(yi)器默認的(de)螢火蟲熒(ying)光(guang)素酶（Luciferase）的(de)發(fa)(fa)光(guang)檢(jian)(jian)測參數的(de)參數進行發(fa)(fa)光(guang)值(zhi)的(de)檢(jian)(jian)測，5 min內，連續測5次陰性(xing)對(dui)照(zhao)和待(dai)測樣品的(de)發(fa)(fa)光(guang)值(zhi)，計算各(ge)自的(de)平均值(zhi)。
【注1】：發(fa)光檢測（Luminescence）與熒光檢測（Fluorescence）、吸收光檢測（Absorbtance）是不(bu)同的功能。吸收光檢測即常用的(de) OD 值(zhi)檢(jian)(jian)測(ce)。熒光(guang)檢(jian)(jian)測(ce)（比如常見的(de) FITC 檢(jian)(jian)測(ce)）需要激(ji)發(fa)光(guang)，而發(fa)光(guang)檢(jian)(jian)測(ce)（如熒光(guang)素酶(mei)的(de)活性檢(jian)(jian)測(ce)）不需要激(ji)發(fa)光(guang)。多功能(neng)(neng)酶(mei)標(biao)儀常見的(de)檢(jian)(jian)測(ce)功能(neng)(neng)有(you)：吸收光(guang)檢(jian)(jian)測(ce)、熒光(guang)檢(jian)(jian)測(ce)和發(fa)光(guang)檢(jian)(jian)測(ce)，三種功能(neng)(neng)為獨立的(de)功能(neng)(neng)。您(nin)如果不清楚您(nin)實驗(yan)室(shi)的(de)酶(mei)標(biao)儀是(shi)否具有(you)發(fa)光(guang)檢(jian)(jian)測(ce)功能(neng)(neng)，請咨詢您(nin)的(de)實驗(yan)室(shi)主任或者酶(mei)標(biao)儀廠家。
【注2】：發(fa)光(guang)檢(jian)測時，應(ying)該選(xuan)擇(ze)不(bu)(bu)加載任何濾光(guang)片（不(bu)(bu)同(tong)酶(mei)標(biao)儀(yi)表達方式不(bu)(bu)一樣，可能(neng)是：Unfiltered LUM、All wavelengths 或 Open hole）進行檢(jian)測（此時讀值較(jiao)高）或者使用(yong)螢(ying)火蟲熒光(guang)素酶(mei)（Luciferase）峰值的發(fa)光(guang)波(bo)長560 nm進行檢(jian)測（此時讀值較(jiao)低）。
【注3】：可以通過調節(jie)酶(mei)標儀的(de)(de)檢測(ce)靈敏度（Sensitivity）或延長發光(guang)檢測(ce)的(de)(de)時間(jian)（Integration time，Measurement time），盡量讓陰性對照的(de)(de)發光(guang)值大于(yu) 1000。
【注4】：如果樣品(pin)是無血(xue)(xue)(xue)清細胞(bao)培(pei)(pei)養上清，相應的(de)陰性對照(zhao)培(pei)(pei)養基因不含血(xue)(xue)(xue)清，其發(fa)(fa)光(guang)(guang)值可能會比較低(di)， 甚至只有 100 左右(you)的(de)發(fa)(fa)光(guang)(guang)值，此時可以(yi)在陰性對照(zhao)培(pei)(pei)養基中加入10%的(de)胎牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清或(huo)小牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清，當然無血(xue)(xue)(xue)清細胞(bao)上清樣品(pin)也必須(xu)用含10%的(de)胎牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清或(huo)小牛(niu)血(xue)(xue)(xue)清的(de)陰性對照(zhao)培(pei)(pei)養基進行(xing)替(ti)換（高速離心后(hou)替(ti)換，見上述步驟4）后(hou)，再進行(xing)檢測。加入血(xue)(xue)(xue)清后(hou)一(yi)般可以(yi)明顯(xian)提高陰性對照(zhao)的(de)發(fa)(fa)光(guang)(guang)值。
6.結果判斷(duan)
　　計算待測樣品的發(fa)光(guang)平均值與(yu)陰性(xing)對照的發(fa)光(guang)平均值的比值：
（1）如(ru)果比值(zhi)>1.2，說(shuo)明(ming)待測樣品有支原體污(wu)染(ran)（陽性）。嚴重的污(wu)染(ran)該比值(zhi)可以(yi)達到10以(yi)上(shang)。
（2）如果(guo)比值(zhi)在1.1-1.2之(zhi)間(jian)，說明待測樣品可疑(yi)(yi)有支原體污染(ran)（可疑(yi)(yi)陽(yang)性）。該樣品需要繼續(xu)培養(yang)24-48小(xiao)時(shi)后(hou)，重(zhong)新檢測。如果(guo)繼續(xu)培養(yang)24-48小(xiao)時(shi)后(hou)，重(zhong)新檢測的(de)比值(zhi)仍然(ran)在1.1-1.2之(zhi)間(jian)，應(ying)該判為陰性。
（3）如果比值<1.1，說(shuo)明待(dai)測樣品無支原體污染（陰(yin)性）。

表1：本試劑盒產品優勢

產品圖(tu)片(pian)

相關試劑(ji)推薦(jian)
EZ Cell Transfection Reagent（EZ Trans細胞轉染試劑）（貨號：AC04L092）
特(te)優級胎牛血清(extra-special FBS)（貨號：AC03L035 ）