螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61 kD 的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的過程中，會發出生物熒光(Bioluminescence)。海腎熒光素酶是一種分子量約為36 kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide，在Coelenterazine 氧化的過程中也會發出生物熒光。生物熒光可以通過化學發光儀(Luminometer)或液閃測定儀進行測定。

　　在(zai) DLR 檢(jian)(jian)(jian)(jian)測中，螢火蟲（Firefly）熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)和海(hai)(hai)腎（Renilla）熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)活性可在(zai)單個樣(yang)品中依次檢(jian)(jian)(jian)(jian)測。先是先以(yi)(yi)熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)(Luciferin)為底(di)物(wu)來(lai)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測螢火蟲熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)(Firefly Luciferase)，后以(yi)(yi)腸腔素(su)(su)(Coelenterazine)為底(di)物(wu)來(lai)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測海(hai)(hai)腎熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)(Renilla Luciferase)，并在(zai)后續(xu)加入(ru)海(hai)(hai)腎熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)底(di)物(wu)時(shi)，同時(shi)加入(ru)抑制螢火蟲熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)催化Luciferin發(fa)光(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)物(wu)質(zhi)，使后續(xu)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測僅僅檢(jian)(jian)(jian)(jian)測到海(hai)(hai)腎熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)活性，實現雙熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)報告基因(yin)(yin)(yin)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測。通過熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)和其底(di)物(wu)這一生(sheng)物(wu)發(fa)光(guang)(guang)體系，可以(yi)(yi)非(fei)常靈敏(min)、高效(xiao)(xiao)地檢(jian)(jian)(jian)(jian)測基因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)表達。通常把感興趣(qu)基因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄調控元件或5' 啟(qi)動子區克隆(long)在(zai)Luciferase 的(de)(de)(de)(de)上游，或把3'-UTR 區克隆(long)在(zai)Luciferase 的(de)(de)(de)(de)下游等(deng)，構建成(cheng)報告基因(yin)(yin)(yin)(Reporter Gene)質(zhi)粒(li)，然后轉(zhuan)染細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，用(yong)(yong)適(shi)當藥物(wu)等(deng)處理細(xi)(xi)(xi)胞(bao)后裂(lie)解細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，測定熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)活性。通過熒(ying)(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)酶(mei)(mei)活性的(de)(de)(de)(de)高低來(lai)判(pan)斷藥物(wu)處理等(deng)對(dui)目的(de)(de)(de)(de)基因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄調控作用(yong)(yong)。 Renilla Luciferase 相(xiang)對(dui)更多(duo)地被(bei)用(yong)(yong)作轉(zhuan)染效(xiao)(xiao)率的(de)(de)(de)(de)內參，以(yi)(yi)消(xiao)除(chu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)數量和轉(zhuan)染效(xiao)(xiao)率的(de)(de)(de)(de)差異。

　　具有檢測(ce)迅速、靈敏度高、檢測(ce)范圍廣，無細胞內源活性干擾(rao)等特點。

訂購信息

試劑盒組分

保存方法

藍冰運輸。-20℃保存，有效(xiao)期12個月。

【注(zhu)】：C組(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)建(jian)議預先使用B組(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)配制為(wei)2 mg/mL儲液，B組(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)、D組(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)及配制為(wei)儲液的C組(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)，根據實(shi)驗需求(qiu)進行小(xiao)批量分(fen)(fen)裝。所有檢(jian)測工作液建(jian)議現配現用，避免反復凍融。

使用方法
1.細胞裂解
（1）將轉入報告基(ji)因的細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)的培(pei)養(yang)基(ji)移除，加PBS 輕輕洗滌兩次(ci)（貼壁細(xi)胞(bao)(bao)(bao)可(ke)直接進行此操作，懸浮細(xi)胞(bao)(bao)(bao)要離(li)心收(shou)集細(xi)胞(bao)(bao)(bao)）。按如下(xia)方(fang)案(an)加入 1×Lysis Buffer (用無菌水按 4:1 稀             釋(shi) A 組分)， 然后(hou)將培(pei)養(yang)板放(fang)在微型震蕩(dang)器上(shang)室溫震蕩(dang) 15 min，充(chong)分裂(lie)解細(xi)胞(bao)(bao)(bao)。

 注：裂解產物(wu)可(ke)室溫保存(cun) 6 h，-70℃可(ke)長期存(cun)放（裂解產物(wu)不能多次反復凍(dong)融）。如果熒光(guang)素酶的表達水平(ping)比較(jiao)低，可(ke)以(yi)嘗試(shi)使用更(geng)少(shao)的裂解液，例如6孔(kong)板的每孔(kong)用量可(ke)以(yi)小為  ;100μL。

（2）將(jiang)充分裂(lie)解后(hou)的(de)裂(lie)解產(chan)物，10000-15000 rpm 離(li)心(xin) 3-5 min。離(li)心(xin)后(hou)將(jiang)上清液(ye)移(yi)入新的(de) EP 管中進行后(hou)續檢測。

（3）細胞裂解后(hou)可(ke)以立即(ji)測定熒光(guang)素酶，也可(ke)以先凍(dong)存，待以后(hou)再(zai)測定。凍(dong)存樣品需(xu)融解，并達到室溫(wen)后(hou)再(zai)進行(xing)測定。

2. 工作液配制

（1）用(yong)B 組(zu)分充(chong)分溶(rong)解C 組(zu)分，配制成0.2 mg/mL的螢(ying)火蟲熒(ying)光素(su)酶檢測液。

注：螢火蟲熒光素(su)酶工作(zuo)液不能反復凍融，若單次(ci)實驗用量較少，建議按單次(ci)使(shi)用量分(fen)裝成小規格。

（2）用D組(zu)分(fen)將(jiang)E組(zu)分(fen)稀(xi)釋成1× Coelenterazine工(gong)作液，稀(xi)釋方(fang)法(fa)為(wei)將(jiang)1 µL E組(zu)分(fen)加入到49 µL D組(zu)分(fen)中，此稀(xi)釋方(fang)法(fa)可(ke)按比(bi)例相應擴大。

注：1× Coelenterazine工作液應該現用現配。
3. 化學發光值檢測

（1）將上述配制好的螢火蟲(chong)熒光素(su)檢測液(ye)(ye)和(he)1× Coelenterazine工(gong)作液(ye)(ye)恢復至室溫。

（2）按儀器操作說明書開(kai)啟化(hua)學(xue)(xue)發光儀或具有(you)檢(jian)測(ce)化(hua)學(xue)(xue)發光功(gong)能的多功(gong)能酶標儀，將測(ce)定間隔設(she)為(wei)2 s，測(ce)定時(shi)間設(she)為(wei)10 s。

（3）每個樣(yang)(yang)品(pin)(pin)測定時，取樣(yang)(yang)品(pin)(pin)20-100μL(如果(guo)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)量(liang)足(zu)夠，請加(jia)入100μL；如果(guo)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)量(liang)不(bu)足(zu)可以適(shi)當減(jian)少用(yong)量(liang)，但同批樣(yang)(yang)品(pin)(pin)的使用(yong)量(liang)宜保(bao)持一致)。

（4）加入100μL螢火蟲熒光素(su)酶(mei)檢測試(shi)劑，用槍打勻或(huo)用其它(ta)適(shi)當方式混勻后測定RLU(relative light unit)。以報告基因細胞裂解液為(wei)空(kong)白對照。

注：由于該發光(guang)為(wei)瞬時(shi)發光(guang)，建議加入螢火蟲熒光(guang)素(su)酶檢測(ce)試劑后，立即進行(xing)發光(guang)值的(de)檢測(ce)。

（5）在完成(cheng)上述測(ce)定螢火(huo)蟲熒光素(su)(su)酶步驟(zou)后，加入 100 μL海腎熒光素(su)(su)酶檢測(ce)工作液，用槍打勻或用其它適(shi)當方式混勻后測(ce)定RLU(relative light unit)。

（6）在以(yi)海(hai)腎熒(ying)(ying)光(guang)素酶(mei)(mei)為(wei)內參(can)的(de)(de)情(qing)況(kuang)下，用(yong)螢(ying)火蟲(chong)熒(ying)(ying)光(guang)素酶(mei)(mei)測定得到(dao)的(de)(de) RLU 值除(chu)以(yi)海(hai)腎熒(ying)(ying)光(guang)素酶(mei)(mei)測定得到(dao)的(de)(de) RLU 值。根據得到(dao)的(de)(de)比值來比較(jiao)不(bu)同樣品(pin)間目的(de)(de)報告基因的(de)(de)激活(huo)程度(du)。如(ru)果(guo)以(yi)螢(ying)火蟲(chong)熒(ying)(ying)光(guang)素酶(mei)(mei)為(wei)內參(can)，也(ye)可以(yi)進(jin)行(xing)類似計算。

注意事項
1. 為(wei)取(qu)得(de)理(li)想測定(ding)效果，在(zai)用單管的化學(xue)發(fa)光(guang)儀(yi)測(ce)定(ding)時(shi)，樣品和測(ce)定(ding)試(shi)劑混合(he)后到測(ce)定(ding)前的時(shi)間(jian)應盡量控制一致；使用具有化學(xue)發(fa)光(guang)測(ce)定(ding)功(gong)能(neng)的多(duo)功(gong)能(neng)熒光(guang)酶(mei)標(biao)儀(yi)時(shi)，宜先(xian)把樣品全部加好(hao)，然(ran)后統一加入螢火蟲熒光(guang)素酶(mei)檢測(ce)試(shi)劑。

2. 由于溫度對酶(mei)反應有影響(xiang)，所以測定(ding)時樣品(pin)和試劑均需達到(dao)室溫后再(zai)進行測定(ding)

3. 為了您的安全和健康，請穿(chuan)實驗(yan)服并(bing)戴(dai)一次性手套操作(zuo)。